Racionálny dizajn molekúl proteínov. Aplikácia proteínového inžinierstva. Aké výrazové systémy poznáte

Dictionary Elution Elution je metóda extrakcie látky (vírusu) z pevného nosiča vymývaním Metóda displeja Metóda zobrazenia je metóda prezentácie heterológnych proteínov / peptidov na povrchu vírusov, buniek alebo bezbunkových kultúr na selekciu proteínov alebo peptidov s požadovanými vlastnosťami Biosensor Biosensor - analytický systém (biologický materiál + konvertor Elution Elution je metóda extrakcie látky (vírusu) z pevného nosiča jeho vymytím Display method Display method je metóda prezentácie heterológnych proteínov/peptidov na povrchu vírusov, buniek alebo bezbunkových vlastností Biosensor Biosensor je analytický systém (biologický materiál + prevodník), ktorý umožňuje detekciu látok v testovanej vzorke a odhad ich koncentrácií

Proteínové inžinierstvo 4 Súbor metód a prístupov na štúdium proteínov a získavanie proteínov s novými vlastnosťami HLAVNÉ CIELE Vytvoriť knižnicu nukleotidových a aminokyselinových sekvencií Skúmať účinky substitúcií jednotlivých aminokyselinových zvyškov na skladanie a funkciu proteínov Vyvinúť metódy na účinnú modifikáciu proteínov dať im potrebné vlastnosti Vyvinúť metódy a prístupy na skríning a selekciu proteínov s požadovanými vlastnosťami

Racionálny dizajn Racionálny dizajn Potreba vedomostí o priestorovej organizácii proteínu Potreba vedomostí o intra- a intermolekulárnych interakciách Nedokonalé metódy a smerovanie zariadení zamerané na vytváranie nových proteínov de novo ich priestorovým dizajnom

Riadený vývoj molekúl proteínov smer zameraný na vytváranie nových proteínov prostredníctvom selekcie 1 získanie klonových knižníc náhodných aminokyselinových sekvencií 2 výber polypeptidových reťazcov, ktoré majú aspoň malý stupeň požadovaných vlastností 3 pomocou náhodnej mutagenézy získanie nových knižníc proteínových klonov, ktoré sa používajú v ďalšom kole selekcie alebo pomocou geneticky upravených konštruktov exprimujúcich nové proteíny

Riadená evolúcia proteínových molekúl (variantov) racionálny redizajn využívajúci miestne cielenú mutagenézu na nahradenie špecifických aminokyselinových zvyškov v aktívnom mieste enzýmového inžinierstva proteínových povrchov pomocou mutácií na zmenu častí polypeptidového reťazca v blízkosti aminokyselinových zvyškov ktoré sú blízko seba na povrchu proteínovej globule, ale nachádzajú sa v značnej vzdialenosti od seba v polypeptidovom reťazci

Skríning a selekcia proteínov s cieľovými vlastnosťami Náhodný skríning Zlepšený skríningový výber Každý proteín sa testuje na požadované vlastnosti; výber proteínov z knižnice je náhodný, každý proteín sa skúma na prítomnosť požadovaných vlastností; výber proteínov z knižnice je možný náhodne, ak sa objekty tvoriace knižnicu fenotypovo líšia (napríklad prítomnosťou enzymatickej aktivity) sú vytvorené podmienky na selektívne uchovanie komponentov knižnice, ktoré majú určité vlastnosti (fág, bunka display) sú vytvorené podmienky na selektívne uchovanie komponentov knižnice, ktoré majú určité vlastnosti (fág, bunkový display) detekcia proteínu s požadovanými vlastnosťami medzi veľkým počtom makromolekúl, ktoré tvoria výslednú klonovú knižnicu

Fágový displej Účel - exponovať cudzie proteíny na povrchu fágu Metóda bola vyvinutá v roku 1985 pre filamentózny bakteriofág M13. (gény pIII a pVIII sú vhodné cieľové miesta na inzerciu cudzieho fragmentu cDNA) Cieľom je exponovať cudzie proteíny na povrchu fága Metóda bola vyvinutá v roku 1985 pre vláknitý bakteriofág M13. (gény pIII a pVIII sú vhodnými cieľovými miestami na inzerciu cudzieho fragmentu cDNA) skonštruujte hybridný gén pozostávajúci z kódujúcich sekvencií cieľového proteínu a jedného z obalových proteínov fága s bakteriofágom infikujúcim E. coli počas zostavovania fágu hybridné proteíny sú začlenené do fágovej častice

Fagemid pomocný fág Fágový genóm Infekcia E. coli s knižnicou pomocných fágových plazmidov/bunky E.coli transformované fagemidom sa infikujú pomocným fágom, aby sa vytvorili fágové častice povrchovo exponované rôznymi variantmi cieľového proteínu plazmidovej knižnice/bunkami E.coli transformovanými fagemidom, sú infikované pomocným fágom, aby sa získali fágové častice, na povrchu ktorých sú vystavené rôzne varianty cieľového proteínu

Perspektívy praktického využitia proteínového inžinierstva Medicína: *získať nové lieky; na vytvorenie diagnostických nástrojov a výrobu vakcín; *študovať mechanizmy imunitnej odpovede, ako aj ochorenia imunitného systému Ekológia: *získať biokatalyzátory vo forme celých buniek s enzýmami imobilizovanými na ich povrchu; *získať biosenzory za účelom diagnostiky a monitorovania životného prostredia; *na tvorbu bio adsorbentov za účelom odstraňovania toxických látok a iónov ťažkých kovov z prostredia

Meranie glukózy pomocou enzýmovej elektródy (schematické znázornenie experimentu L. Clarka). Oxidácia glukózy enzýmom glukózooxidáza za prítomnosti kyslíka: glukóza + O 2 H 2 O 2 + glukono-1,5-laktón. H 2 O 2 sa redukuje na platinovej elektróde pri potenciáli +700 mV; prúd tečúci v obvode je úmerný koncentrácii peroxidu vodíka (t.j. nepriamo glukózy).

Slovník Imobilizácia Imobilizácia je obmedzenie pohyblivosti molekúl a ich potvrdzovacie prestavby Aerotank Aerotank je systém čistenia odpadových vôd, nádrže, v ktorých sú WW, mikrobiálny kal a vzduch zmiešané čistenie vody, pôdy a atmosféry s využitím metabolického potenciálu biologických objektov - rastlín , huby, hmyz, červy a iné organizmy Imobilizácia Imobilizácia je obmedzenie pohyblivosti molekúl a ich potvrdenie prestavby a vzduchu Metánová nádrž Metánová nádrž je zásobník na biologické spracovanie organických polutantov pomocou baktérií v anaeróbnych podmienkach Bioremediácia Bioremediácia je súbor metód na čistenie vody, pôdy a atmosféry s využitím metabolického potenciálu biologických objektov - rastlín, húb, hmyzu, červov a iných organizmov

Klasifikácia enzýmov Trieda Katalyzované reakcie Príklady enzýmov Oxidoreduktázy Redukčné a oxidačné reakcie Je známych viac ako 200 enzýmov. Kataláza, glukózooxidáza Transferázy Reverzibilný prenos skupín atómov z donorov na akceptory. Je známych viac ako 450 enzýmov. Pyruvátkináza, proteínkináza Hydrolázy Hydrolyzačné reakcie Je známych viac ako 200 hydroláz. Proteáza, amyláza, celuláza Lyázy Nehydrolytické odštiepenie skupín atómov zo substrátu za vzniku dvojitých väzieb Je známych viac ako 100 lyáz. Aspartáza, fumaráza Izomerázy Intramolekulárne prešmykové reakcie organických zlúčenín Je známych viac ako 50 enzýmov. Glukoseimerázové ligázy Vzájomné väzbové reakcie dvoch rôznych molekúl Je známych viac ako 100. DNA ligáza, tryptofánsyntetáza

Mikroorganizmy Zdroje enzýmov Bacily sú biosyntetizátory ribonukleáz, deoxyribonukleáz a proteáz, zatiaľ čo kvasinky sú biosyntetizátory glukoamyláz, invertáz a kyslej fosfatázy Rastliny amyláza sa izoluje z jačmeňa, kyslá fosfatáza zo zemiakov, chrenová peroxidáza z chrenu z chrenu dehydrogenáza Zvieratá alkalická fosfatáza sa izoluje zo žalúdka . Na získanie pepsínu sa používa žalúdok ošípaných, zo srdca hovädzieho dobytka sa izoluje laktátdehydrogenáza a zo žalúdka alkalická fosfatáza. Prasací žalúdok sa používa na výrobu pepsínu

Imobilizačné metódy Fyzikálne metódy Chemické metódy adsorpcia na nerozpustný nosič, inkorporácia do gélových pórov, priestorová separácia pomocou semipermeabilnej membrány a iné sú založené na vytváraní nových kovalentných väzieb medzi enzýmom a nosičom

Výhodou imobilizovaných enzýmov je oddelenie enzýmov od reakčného média, zastavenie reakcie v správnom čase a získanie produktu, ktorý nie je kontaminovaný enzýmom; uskutočňovať proces v kontinuálnom režime a kontrolovať rýchlosť reakcie; meniť vlastnosti katalyzátora, jeho špecifickosť, závislosť od reakčných podmienok a citlivosť na denaturačné účinky; regulujú katalytickú aktivitu enzýmu pôsobením na nosič

Enzýmy v biotechnologickej výrobe Zdroj enzýmu, metóda imobilizácie Biotechnológia Acetyl neutraminát -9-fosfát syntáza Enzým E. coli. Zapracovanie do polyakrylamidového gélu. Syntéza sialových kyselín. Peroxidáza Enzým z chrenu. Kopolymerizácia a inkorporácia do alginátového gélu. Oxidácia fenolu v odpadových vodách. 3-ketosteroid dehydrogenáza Bunky Mycobacterium globiformis. Zapracovanie do polyakrylamidového gélu. Transformácia hydrokortizónu na prednizolón

Lavryashina M.B. KemSU Metódy ekologickej biotechnológie Biologické čistenie odpadových vôd Bio(fyto)sanácia Tvorba biologicky bezpečných insekticídov a herbicídov Tvorba biologicky bezpečných insekticídov a herbicídov Získavanie čistej energie Vytváranie poľnohospodárskych rastlín odolných voči chorobám Bakteriálne vyplavovanie kovov Klonovanie ohrozených a vyhynutých druhov zvierat

Metódy čistenia odpadových vôd Mechanické (usadzovanie, filtrácia) Mechanické Chemické (vplyv reagentov) Chemické Fyzikálne a chemické Biologické (biochemické samočistenie)) Biologické Najdôležitejším problémom biotechnológie je čistenie odpadových vôd

Aerotanky pracujú v kombinácii s ekvalizérom, usadzovacími nádržami, regenerátorom kalu a zhutňovačom kalu (lisom). aerotank aerotank

Metánová nádrž Metánová nádrž (z metánu a angl. nádrž - nádrž, cisterna) Skupiny baktérií Východiskové látky Produkty HYDROLYTICKÉ ACETOGÉNNE Organické polutanty Vyššie mastné kyseliny PRODUKOVANÝ VODÍK Vyššie mastné kyseliny H 2, CO 2, CH 3 COOH METÁN GENERUJÚCI H 2, CO 2 , CH3COOH CH4, CO2

Fázy metánovej fermentácie 1 biohydrolýza polyméru a acidogenéza (organické látky sa premieňajú na vyššie mastné kyseliny, acetát a vodík) 2 acetogenéza a dehydrogenéza (z vyšších mastných kyselín vzniká acetát a vodík) 3 Metanogenéza (vzniká metán, vodík a oxid uhličitý z acetát)

Fázujem. ROZVOJ CELULÓZY (Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens) PROTEOLITICKÝ PROTEOLIT (Clostridium, Petrococcus) Fáza II. ACETOGÉNNA (Syntrophobacter wolinii) fáza III. METANOGENERÁTORY (Metanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus vannielii) Príklady mikroorganizmov

BIOREMEDIÁCIA Metóda je založená na schopnosti mikroorganizmov využívať zložité organické látky a rozkladať ich na jednoduché „biologicky bezpečné“ látky Molekulárna biológia a genetika Ekológia Inžinierske vedy Mikrobiológia BIOREMEDIÁCIA

Bioremediácia. Prístupy. Využitie aktivity prirodzených „divokých“ mikroorganizmov Využitie aktivity prirodzených „divokých“ mikroorganizmov (potrebný je intenzifikátor napr. O 2) Použitie aktívnych kmeňov zavedených vo forme biologických produktov v miestach intenzívneho znečistenia

Štúdium biodiverzity kontaminovaných oblastí Izolácia mikroflóry schopnej ničiť odstránené škodliviny Aktivácia lokálnej mikroflóry (biostimulácia). Zavedenie špeciálnych mikroorganizmov-deštruktorov do kontaminovaných oblastí (bioremediácia) Bioremediácia. Etapy.

KONTAMINANTY Chemická analýza Inžinierske technológie Biostimulácia (Prírodné mikrobiálne spoločenstvá) Biostimulácia Bioremediácia (Umelé mikrobiálne biologické produkty) Bioremediácia Monitoring bioremediácie Biofytoremediácia (spoločenstvá rastlín a mikroorganizmov) Biofytoremediácia

Konštrukcia transgénnych rastlín odolných voči hmyzím škodcom 1. SYNTÉZA ŠPECIFICKÝCH TOXÍNOV 2. SYNTÉZA HYDROLYTICKÝCH ENZÝMOV OVPLYVŇUJÚCICH BUNEČNÉ STENY HMYZOV A INÝCH ŠKODCOV A PATOGÉNOV /CHITINÁZA, -1,3-PRÍNTSYBLUKONÁZA,PRÍTSYBLUKONÁZA PROTEINÁZOVÝCH INHIBITOROV A INHIBITOROV ENZÝMOV, KTORÉ ZNIŽUJÚ RASTLINNÉ POLYSACHARIDY 4. ÚPRAVA SEKUNDÁRNEHO METABOLIZMU RASTLÍN PRE: A) OBMEDZENIE POTREBNÝCH LÁTOK B) SYNTÉZU NOVÝCH REPELENTOV A TSEOXTIVESPELENTOV5. GÉNOVÝ VÝRAZ ŠPECIFICKÝ PRE UE B ) REGULÁCIA GÉNOVEJ EXPRESIE RÔZNYMI PRÍRODNÝMI A UMELÝMI FAKTORMI Zvýšená odolnosť transgénnych rastlín voči hubovému patogénu Phomopsis helianhi Zvýšená odolnosť transgénnych rastlín voči hubovému patogénu Phomopsis helianhi A B A - netransgénna rastlina B - transgénna rastlina B - netransgénna rastlina - transgénna rastlina

Orientačný zoznam tém zaradených do testu na zápočet 1. História biotechnológií. Charakteristika historických období. Najvýznamnejšie objavy, ktoré zohrali dôležitú úlohu vo vývoji vedy. 2. Všeobecné pojmy biotechnológie: biotechnologický systém, biotechnologický proces, biotechnologický objekt. 3. Biotechnologické objekty, definícia, charakteristika miesta bioobjektu v biotechnologickom systéme, klasifikácia, príklady praktickej aplikácie. 4. Mikroorganizmy ako biologické objekty. Príklady, praktické využitie v biotechnológiách. 5. Bunkové a tkanivové kultúry ako biologické objekty. Príklady, praktické využitie v biotechnológiách. 6. Biotechnologický proces. Etapy. Stručný popis fáz biotechnologického procesu. 7. Charakteristika mikroorganizmov ako objektov selekcie. Selekcia mikroorganizmov v biotechnológiách. 8. Mutagenéza: definícia, formy mutagenézy, mutagénne faktory. 9. Selekcia mutantných mikroorganizmov vytvorených v procese selekcie v prípravnom štádiu biotechnologického procesu. 10. Selekcia biologických objektov. Etapy, prístupy, metódy.

11. Genetické inžinierstvo: účel, technika, biologické objekty, príklady praktickej aplikácie, moderné výdobytky. 12. Enzýmy genetického inžinierstva. Klasifikácia, charakteristika katalyzovaných reakcií. 13. Metódy získania génu v genetickom inžinierstve. Stručný popis, výhody a nevýhody metód. 14. Vektory v genetickom inžinierstve. Definícia, klasifikácie, požiadavky, stručný popis vektorov. 15. Rekombinantná DNA. Definícia, účel, metódy získavania rekombinantnej DNA v genetickom inžinierstve. 16. Spôsoby zavedenia rekombinantnej DNA do recipientnej bunky a selekcie modifikovaných buniek v genetickom inžinierstve. 17. Transgenéza rastlín. Vektor. Základné stratégie. Spôsoby zavádzania transgénov a selekcie transgénnych organizmov. 18. Transgenéza zvierat. Vektor. Základné stratégie. Spôsoby zavádzania transgénov a selekcie transgénnych organizmov. 19. Bunkové inžinierstvo: účel, technika, biologické objekty, príklady praktickej aplikácie, moderné výdobytky. 20. Spôsoby kultivácie rastlinných buniek a tkanív. Podmienky kultivácie, klasifikácia a stručná charakteristika rastlinných kultúr v bunkovom inžinierstve

21. Somatické hybridy rastlín. Technika výroby, moderné výdobytky, príklady praktického použitia. 22. Protoplasty: definícia, využitie v bunkovom inžinierstve, metódy a podmienky izolácie protoplastov. 23. Kultivácia a fúzia protoplastov v bunkovom inžinierstve. Metódy, podmienky, fuzogény. 24. Praktické využitie bunkových kultúr a rastlinných pletív. Biosyntéza a biotransformácia, mikropropagácia, príklady transgénnych rastlín s cennými vlastnosťami. 25. Živočíšne bunkové inžinierstvo. Metódy, predmety, technika, moderné výdobytky, praktická aplikácia. 26. Bunkové a tkanivové kultúry zvierat. Klasifikácia plodín, podmienky pestovania, médiá, spôsoby získavania somatických hybridov, praktické využitie. 27. Kmeňové bunky. Charakteristický. Klasifikácia. Vyhliadky na uplatnenie. 28. Klonovanie. Charakteristika metódy. Klasifikácia. Vyhliadky na uplatnenie. 29. Biotechnologický proces. Kultivačná fáza. Hlavné štádiá, charakterizácia médií pre mikroorganizmy, rastlinné a živočíšne bunky. Vybavenie. 30. Biotechnologický proces. Kultivačná fáza. Spôsoby pestovania biologických objektov. Etapy rastu kultúry v bioreaktore, syntéza cieľového produktu.

31. Biotechnologický proces. Fáza získania produktu. Hlavné etapy a spôsoby separácie a čistenia biotechnologického produktu. Príklady biotechnologických produktov. 32. Ekologická biotechnológia: účel, metódy, biologické objekty, príklady praktického využitia, moderné výdobytky. 33. Ekologická biotechnológia. Problém pitnej vody. Aeróbne metódy čistenia odpadových vôd. 34. Ekologická biotechnológia. Problém pitnej vody. Anaeróbne metódy čistenia odpadových vôd. 35. Ekologická biotechnológia. Bioremediácia, biofytoremediácia. 36. Biotechnológia: účel, predmet, úlohy, hlavné smery biotechnológie. Moderné výdobytky v oblasti biotechnológií. 37. Inžinierska enzymológia. Účel, problémy. Perspektívy. Zdroje enzýmov. 38. Imobilizované enzýmy. Výhody, spôsoby imobilizácie. 39. Imobilizované enzýmy. Nosiče na imobilizáciu, praktické využitie. 40. Proteínové inžinierstvo. Smery, metódy, vyhliadky.

Proteínové inžinierstvo je odvetvie biotechnológie, ktoré sa zaoberá vývojom užitočných alebo hodnotných proteínov. Ide o relatívne novú disciplínu, ktorá sa zameriava na štúdium skladania proteínov a princípov modifikácie a dizajnu proteínov.

Existujú dve hlavné stratégie proteínového inžinierstva: riadená proteínová modifikácia a riadená evolúcia. Tieto metódy sa navzájom nevylučujú; výskumníci často používajú oboje. V budúcnosti môžu podrobnejšie znalosti o štruktúre a funkcii proteínov, ako aj pokroky v špičkových technológiách výrazne rozšíriť možnosti proteínového inžinierstva. Výsledkom je, že aj neprirodzené aminokyseliny môžu byť zahrnuté vďaka novej metóde, ktorá umožňuje začlenenie nových aminokyselín do genetického kódu.

Proteínové inžinierstvo vzniklo na priesečníku proteínovej fyziky a chémie a genetického inžinierstva. Rieši problém tvorby modifikovaných alebo hybridných proteínových molekúl s požadovanými vlastnosťami. Prirodzeným spôsobom realizácie takejto úlohy je predpovedanie štruktúry génu kódujúceho modifikovaný proteín, implementácia jeho syntézy, klonovania a expresie v recipientných bunkách.

Prvú kontrolovanú modifikáciu proteínu vykonali v polovici 60. rokov minulého storočia Koshland a Bender. Na nahradenie hydroxylovej skupiny sulfhydrylovou skupinou v aktívnom centre proteázy, subtilizíne, použili metódu chemickej modifikácie. Ako sa však ukázalo, takýto tiolsubtilizín si nezachováva proteázovú aktivitu.

Proteín z chemického hľadiska je molekula rovnakého typu, ktorou je polyaminokyselinový reťazec alebo polymér. Skladá sa z aminokyselinových sekvencií 20 typov. Keď sa ľudia naučili štruktúru bielkovín, položili si otázku: je možné navrhnúť úplne nové aminokyselinové sekvencie tak, aby plnili funkcie, ktoré človek potrebuje, oveľa lepšie ako bežné proteíny? Pre túto myšlienku vznikol názov Protein Engineering.

O takomto inžinierstve začali uvažovať už v 50-tych rokoch XX storočia. Stalo sa tak ihneď po dekódovaní prvých proteínových aminokyselinových sekvencií. V mnohých laboratóriách sveta boli urobené pokusy duplikovať prírodu a chemicky syntetizovať polyaminokyselinové sekvencie dané absolútne ľubovoľne.

Najviac sa to podarilo chemikovi B. Merrifieldovi. Tomuto Američanovi sa podarilo vyvinúť mimoriadne účinnú metódu syntézy polyaminokyselinových reťazcov. Merrifield za to dostal v roku 1984 Nobelovu cenu za chémiu.

Obrázok 1. Schéma fungovania proteínového inžinierstva

Američan začal syntetizovať krátke peptidy vrátane hormónov. Zároveň zostrojil automat – „chemického robota“ – ktorého úlohou bolo vyrábať umelé proteíny. Robot vyvolal vo vedeckých kruhoch senzáciu. Čoskoro sa však ukázalo, že jeho produkty nemôžu konkurovať tomu, čo produkuje príroda.

Robot nedokázal presne reprodukovať sekvencie aminokyselín, to znamená, že sa mýlil. Syntetizoval jeden reťazec s jednou sekvenciou a druhý s mierne upravenou. V bunke sú všetky molekuly jedného proteínu v ideálnom prípade navzájom podobné, to znamená, že ich sekvencie sú úplne rovnaké.

Bol tu aj ďalší problém. Ani tie molekuly, ktoré robot správne syntetizoval, nenadobudli priestorovú formu, ktorá je potrebná pre fungovanie enzýmu. Pokus nahradiť prírodu bežnými metódami organickej chémie teda viedol k veľmi skromnému úspechu.

Vedci sa museli učiť od prírody, hľadať potrebné úpravy bielkovín. Ide tu o to, že v prírode sa neustále vyskytujú mutácie, ktoré vedú k zmene aminokyselinových sekvencií proteínov. Ak vyberieme mutanty s potrebnými vlastnosťami, ktoré efektívnejšie spracujú ten či onen substrát, potom je možné z takéhoto mutanta izolovať zmenený enzým, vďaka ktorému bunka získava nové vlastnosti. Ale tento proces trvá veľmi dlho.

Všetko sa zmenilo, keď sa objavilo genetické inžinierstvo. Vďaka nej začali vytvárať umelé gény s akoukoľvek sekvenciou nukleotidov. Tieto gény boli vložené do pripravených vektorových molekúl a tieto DNA boli vložené do baktérií alebo kvasiniek. Tam bola z umelého génu odstránená kópia RNA. V dôsledku toho bol produkovaný požadovaný proteín. Chyby v jeho syntéze boli vylúčené. Hlavné bolo vybrať správnu sekvenciu DNA a potom bezchybne odviedol svoju prácu aj samotný enzymatický systém bunky. Môžeme teda konštatovať, že genetické inžinierstvo otvorilo cestu proteínovému inžinierstvu v jeho najradikálnejšej forme.

Stratégie proteínového inžinierstva

Cielená modifikácia proteínov. Pri cielenej modifikácii proteínu používa vedec podrobné znalosti o štruktúre a funkcii proteínu na uskutočnenie požadovaných zmien. Vo všeobecnosti má táto metóda tú výhodu, že je nenákladná a technicky nekomplikovaná, pretože techniky miestne cielenej mutagenézy sú dobre vyvinuté. Jeho hlavnou nevýhodou však je, že často chýbajú informácie o podrobnej štruktúre proteínu a aj keď je štruktúra známa, môže byť veľmi ťažké predpovedať vplyv rôznych mutácií.

Softvérové algoritmy na modifikáciu proteínov sa snažia identifikovať nové aminokyselinové sekvencie, ktoré vyžadujú málo energie na vytvorenie vopred určenej cieľovej štruktúry. Zatiaľ čo sekvencia, ktorá sa má nájsť, je veľká, najnáročnejšou požiadavkou na modifikáciu proteínu je rýchly, ale presný spôsob identifikácie a určenia optimálnej sekvencie na rozdiel od podobných suboptimálnych sekvencií.

Riadená evolúcia. V riadenej evolúcii sa na proteín aplikuje náhodná mutagenéza a uskutoční sa selekcia na výber variantov, ktoré majú určité kvality. Aplikujú sa ďalšie kolá mutácie a selekcie. Táto metóda napodobňuje prirodzený vývoj a vo všeobecnosti poskytuje vynikajúce výsledky pri riadenej modifikácii.

Ďalšia technika, známa ako DNA shuffling, mieša a prináša časti úspešných variantov pre lepšie výsledky. Tento proces napodobňuje rekombinácie, ktoré sa prirodzene vyskytujú počas sexuálneho rozmnožovania. Výhodou riadenej evolúcie je, že nevyžaduje predchádzajúce znalosti o štruktúre proteínov, ani nie je potrebná, aby bolo možné predpovedať, aký vplyv bude mať daná mutácia. Výsledky experimentov s riadenou evolúciou sú skutočne prekvapujúce, pretože požadované zmeny sú často spôsobené mutáciami, ktoré by nemali mať taký účinok. Nevýhodou je, že táto metóda vyžaduje vysokú priepustnosť, čo nie je možné pre všetky proteíny. Veľké množstvo rekombinantnej DNA musí byť zmutované a produkty musia byť testované na požadovanú kvalitu. Obrovské množstvo možností si často vyžaduje nákup robotiky na automatizáciu procesu. Okrem toho nie je vždy ľahké preveriť všetky zaujímavé vlastnosti.

Práca na kurze

disciplína: Poľnohospodárska biotechnológia

na tému: "Proteínové inžinierstvo"

Úvod. proteínové inžinierstvo

2 Stratégie proteínového inžinierstva. Príklady umelých proteínov. Aplikácia proteínového inžinierstva

1 Knižnice peptidov a epitopov

2 Reportérové proteíny vo fúznych proteínoch

3 Niektoré úspechy proteínového inžinierstva.

Záver

Bibliografia

Esej

R&D: Proteínové inžinierstvo.

Kľúčové slová: biotechnológia, genetické inžinierstvo, proteín, genetický kód, gén, DNA, RNA, ATP, peptidy, epitop.

Cieľ predmetovej práce: štúdium konceptu "proteínového inžinierstva" a potenciálu jeho využitia.

Potenciálne možnosti proteínového inžinierstva:

Zmenou väzbovej sily premenenej látky - substrátu - s enzýmom je možné zvýšiť celkovú katalytickú účinnosť enzymatickej reakcie.

Zvýšením stability proteínu v širokom rozsahu teplôt a kyslosti média je možné ho použiť v podmienkach, za ktorých pôvodný proteín denaturuje a stráca svoju aktivitu.

Vytvorením proteínov, ktoré môžu fungovať v bezvodých rozpúšťadlách, je možné uskutočňovať katalytické reakcie za nefyziologických podmienok.

Zmenou katalytického centra enzýmu je možné zvýšiť jeho špecifickosť a znížiť počet nežiaducich vedľajších reakcií.

Zvýšením odolnosti proteínu voči enzýmom, ktoré ho rozkladajú, je možné zjednodušiť postup jeho čistenia.

Úpravou proteínu tak, aby mohol fungovať bez svojej obvyklej neaminokyselinovej zložky (vitamín, atóm kovu a pod.), je možné ho využiť v niektorých kontinuálnych technologických procesoch.

Zmenou štruktúry regulačných oblastí enzýmu je možné znížiť stupeň jeho inhibície produktom enzymatickej reakcie vo forme negatívnej spätnej väzby a tým zvýšiť výťažok produktu.

Môžete vytvoriť hybridný proteín, ktorý má funkcie dvoch alebo viacerých proteínov.

Je možné vytvoriť fúzny proteín, ktorého jedna z častí uľahčuje výstup fúzneho proteínu z kultivovanej bunky alebo jeho extrakciu zo zmesi.

Úvod

Biotechnológia sa od nepamäti využíva najmä v potravinárskom a ľahkom priemysle: vo vinárstve, pečení, fermentácii mliečnych výrobkov, pri spracovaní ľanu a kože na báze využitia mikroorganizmov. V posledných desaťročiach sa možnosti biotechnológií enormne rozšírili. Je to spôsobené tým, že jej metódy sú výnosnejšie ako konvenčné z jednoduchého dôvodu, že v živých organizmoch prebiehajú biochemické reakcie katalyzované enzýmami za optimálnych podmienok (teplota a tlak), sú produktívnejšie, šetrnejšie k životnému prostrediu a nevyžadujú chemikálie. ktoré otravujú životné prostredie.

Predmetom biotechnológie sú početní zástupcovia skupín živých organizmov - mikroorganizmy (vírusy, baktérie, prvoky, kvasinkové huby), rastliny, živočíchy, ako aj izolované bunky a subcelulárne zložky (organely) a dokonca aj enzýmy. Biotechnológia je založená na fyziologických a biochemických procesoch prebiehajúcich v živých systémoch, ktorých výsledkom je uvoľňovanie energie, syntéza a rozklad produktov metabolizmu, tvorba chemických a štrukturálnych zložiek bunky.

Hlavným smerom biotechnológie je výroba biologicky aktívnych zlúčenín (enzýmy, vitamíny, hormóny), liečiv (antibiotiká, vakcíny, séra, vysokošpecifické protilátky atď.) pomocou mikroorganizmov a kultivovaných eukaryotických buniek, ako aj cenných zlúčenín. (kŕmne doplnkové látky, napr. esenciálne aminokyseliny, kŕmne bielkoviny atď.).

Metódy genetického inžinierstva umožnili v priemyselných množstvách syntetizovať také hormóny, ako je inzulín a somatotropín (rastový hormón), ktoré sú potrebné na liečbu ľudských genetických chorôb.

Biotechnológia rieši nielen špecifické problémy vedy a výroby. Má globálnejšiu metodologickú úlohu - rozširuje a urýchľuje rozsah vplyvu človeka na divokú prírodu a prispieva k prispôsobovaniu živých systémov podmienkam ľudskej existencie, teda noosfére. Biotechnológia tak pôsobí ako silný faktor v antropogénnej adaptívnej evolúcii.

Biotechnológia, genetické a bunkové inžinierstvo majú sľubné vyhliadky. S objavovaním sa stále nových a nových vektorov ich človek použije na zavedenie potrebných génov do buniek rastlín, zvierat a ľudí. To sa postupne zbaví mnohých dedičných ľudských chorôb, prinúti bunky syntetizovať potrebné lieky a biologicky aktívne zlúčeniny a potom priamo konzumované bielkoviny a esenciálne aminokyseliny. Biotechnológovia dúfajú, že pomocou metód, ktoré už zvládla príroda, získajú fotosyntézou vodík – najekologickejšie palivo budúcnosti, elektrinu, za normálnych podmienok premenia atmosférický dusík na amoniak.

Fyzikálne a chemické vlastnosti prírodných bielkovín často nespĺňajú podmienky, v ktorých budú tieto bielkoviny človekom využívané. Vyžaduje sa zmena jeho primárnej štruktúry, ktorá zabezpečí vytvorenie proteínu s inou ako doteraz, priestorovou štruktúrou a novými fyzikálno-chemickými vlastnosťami, ktoré umožňujú vykonávať funkcie prirodzenému proteínu za iných podmienok. Proteínové inžinierstvo sa zaoberá stavbou bielkovín.

Ďalšou oblasťou použitia proteínového inžinierstva je vytváranie proteínov, ktoré dokážu neutralizovať látky a mikroorganizmy, ktoré možno použiť na chemické a biologické útoky. Napríklad hydrolázové enzýmy sú schopné neutralizovať nervové plyny aj pesticídy používané v poľnohospodárstve. Zároveň výroba, skladovanie a používanie enzýmov nie je nebezpečné pre životné prostredie a ľudské zdravie.

Na získanie modifikovaného proteínu sa používajú metódy kombinatorickej chémie a uskutočňuje sa riadená mutagenéza - zavedenie špecifických zmien v kódujúcich sekvenciách DNA, čo vedie k určitým zmenám v sekvenciách aminokyselín. Na efektívne navrhnutie proteínu s požadovanými vlastnosťami je potrebné poznať zákonitosti tvorby priestorovej štruktúry proteínu, od ktorej závisia jeho fyzikálno-chemické vlastnosti a funkcie, to znamená, že je potrebné vedieť, ako vzniká primárna štruktúra proteínu. , každý z jeho aminokyselinových zvyškov ovplyvňuje vlastnosti a funkcie proteínu. Bohužiaľ, pre väčšinu proteínov je terciárna štruktúra neznáma, nie je vždy známe, ktorú aminokyselinu alebo sekvenciu aminokyselín je potrebné zmeniť, aby sa získal proteín s požadovanými vlastnosťami. Vedci pomocou počítačovej analýzy už dokážu predpovedať vlastnosti mnohých proteínov na základe sekvencie ich aminokyselinových zvyškov. Takáto analýza značne zjednoduší postup vytvárania požadovaných proteínov. Medzitým, aby získali modifikovaný proteín s požadovanými vlastnosťami, idú v podstate inou cestou: získajú niekoľko mutantných génov a nájdu proteínový produkt jedného z nich, ktorý má požadované vlastnosti.

Na miestne cielenú mutagenézu sa používajú rôzne experimentálne prístupy. Po prijatí zmeneného génu je tento vložený do genetického konštruktu a vložený do prokaryotických alebo eukaryotických buniek, ktoré syntetizujú proteín kódovaný týmto genetickým konštruktom.

I. Proteínové inžinierstvo

.1 Koncept proteínového inžinierstva. História vývoja

Prvú kontrolovanú modifikáciu proteínu vykonali v polovici 60. rokov minulého storočia Koshland a Bender. Na nahradenie hydroxylovej skupiny sulfhydrylovou skupinou v aktívnom centre proteázy – subtilizíne použili metódu chemickej modifikácie. Ako sa však ukázalo, takýto tiolsubtilizín si nezachováva proteázovú aktivitu.

Obrázok 1. Schéma fungovania proteínového inžinierstva

1.2 Stratégie proteínového inžinierstva

II. Príklady umelých proteínov

Proteínové inžinierstvo môže byť založené na chemickej modifikácii hotového proteínu, alebo na metódach genetického inžinierstva, ktoré umožňujú produkciu modifikovaných variantov prírodných proteínov.

Návrh určitého biologického katalyzátora sa vykonáva s prihliadnutím na špecifickosť proteínu a katalytickú aktivitu organokovového komplexu. Tu sú príklady takejto modifikácie uskutočnenej na získanie "polosyntetických bio-organických komplexov". Myoglobín vorvaňa je schopný viazať kyslík, ale nemá biokatalytickú aktivitu. Spojením tejto biomolekuly s troma komplexmi prenášajúcimi elektróny s obsahom ruténia, ktoré sa viažu na zvyšky histidínu na povrchu molekúl proteínu, vzniká komplex schopný redukovať kyslík a súčasne oxidovať množstvo organických substrátov, ako je askorbát. rýchlosť takmer rovnaká ako pri prirodzenej askorbátoxidáze. V zásade možno proteíny modifikovať aj inak. Zoberme si napríklad papain. Je to jeden z dobre študovaných proteolytických enzýmov, pre ktorý bola určená trojrozmerná štruktúra. V blízkosti zvyšku cysteínu-25 sa na povrchu molekuly proteínu nachádza predĺžená drážka, v ktorej prebieha proteolýza. Toto miesto môže byť alkylované flavínovým derivátom bez toho, aby sa zmenila dostupnosť potenciálneho väzbového miesta substrátu. Takto modifikované flavopapaíny boli použité na oxidáciu M-alkyl-1,4-dihydronikotínamidov a katalytická aktivita niektorých z týchto modifikovaných proteínov bola významne vyššia ako katalytická aktivita prirodzených flavoproteínových NADH dehydrogenáz. Tak bolo možné vytvoriť veľmi účinný polosyntetický enzým. Použitie flavínov s vysoko aktívnymi substituentmi priťahujúcimi elektróny umiestnenými v určitej polohe môže umožniť vývoj účinných katalyzátorov na redukciu nikotínamidu.

Veľký nedávny pokrok v chemickej syntéze DNA otvoril zásadne nové možnosti pre proteínové inžinierstvo: konštrukciu jedinečných proteínov, ktoré sa v prírode nenachádzajú. To si vyžaduje ďalší vývoj technológie, aby zmena génov metódami genetického inžinierstva viedla k predvídateľným zmenám v proteínoch, k zlepšeniu ich dobre definovaných funkčných charakteristík: počet otáčok, KM pre konkrétny substrát, tepelná stabilita, teplotné optimum, stabilita a aktivita v nevodných rozpúšťadlách, substrátová a reakčná špecifickosť, požiadavka na kofaktor, optimum pH, rezistencia na proteázy, alosterická regulácia, molekulová hmotnosť a štruktúra podjednotky. Typicky sa toto zlepšenie dosiahlo mutagenézou a selekciou a novšie chemickou modifikáciou a imobilizáciou. Na úspešné navrhnutie špecifického typu proteínovej molekuly je potrebné identifikovať množstvo základných vzorov, ktoré spájajú štrukturálne vlastnosti proteínov a ich požadované vlastnosti. Keď teda poznáme presnú kryštálovú štruktúru skúmanej proteínovej molekuly, je možné identifikovať tie jej časti, ktoré by mali byť cielene modifikované, aby sa zvýšila jej katalytická aktivita. Takáto modifikácia môže spočívať v zmene aminokyselinovej sekvencie proteínu.

Ďalším príkladom je implementácia miestne špecifickej mutagenézy. Deje sa to nasledujúcim spôsobom. Gén proteínu, ktorý je pre výskumníka predmetom záujmu, je klonovaný a vložený do vhodného genetického nosiča. Potom sa syntetizuje oligonukleotidový primér s požadovanou mutáciou, ktorého desať až pätnásť nukleotidová sekvencia je dostatočne homológna s určitou oblasťou prirodzeného génu, a preto je schopná s ňou vytvoriť hybridnú štruktúru. Tento syntetický primér využívajú polymerázy na začatie syntézy komplementárnej kópie vektora, ktorá sa potom oddelí od originálu a použije sa na riadenú syntézu mutantného proteínu. Alternatívny prístup je založený na štiepení reťazca, odstránení miesta, ktoré sa má zmeniť, a jeho nahradení syntetickým analógom s požadovanou nukleotidovou sekvenciou.

Tyrozyl-tRNA syntetáza katalyzuje aminoacyláciu tyrozínovej tRNA, ktorá zahŕňa aktiváciu tyrozínu pomocou ATP za vzniku tyrozyladenylátu. Gén pre tento enzým, izolovaný z Bacillus stearothermophilus, bol vložený do bakteriofága M13. Potom sa miestne špecifickou modifikáciou zmenili katalytické vlastnosti enzýmu, najmä jeho schopnosť viazať substrát. Takže treonín-51 bol nahradený alanínom. To viedlo k dvojnásobnému zvýšeniu väzby substrátu, zrejme v dôsledku nemožnosti vytvorenia vodíkovej väzby medzi týmto zvyškom a tyrozyladenylátom. Keď je alanín nahradený prolínom, konfigurácia molekuly enzýmu je narušená, ale schopnosť viazať substrát sa stonásobne zvyšuje, pretože je uľahčená jeho interakcia s histidínom-48. Podobné miestne špecifické zmeny boli pozorované pri p-laktamáze a zvyčajne sú sprevádzané inaktiváciou enzýmu. Nahradenie serínu-70 cysteínom vedie k tvorbe p-tiolaktamázy, ktorej väzbová konštanta sa nelíši od konštanty prirodzeného enzýmu, ale aktivita voči penicilínu je len 1-2%. Napriek tomu aktivita tohto mutantného enzýmu vo vzťahu k niektorým aktivovaným cefalosporínom nie je menšia ako počiatočná aktivita alebo ju dokonca prevyšuje; tieto proteíny sú tiež odolnejšie voči pôsobeniu proteáz.

Mutácie spôsobené pôsobením špecifickým pre danú lokalitu sa dnes používajú na testovanie primeranosti výsledkov štrukturálnych štúdií. V niektorých prípadoch sa použili na preukázanie, že štrukturálna stabilita proteínu a jeho katalytická aktivita môžu byť oddelené. S dostatkom informácií o vzťahu medzi stabilitou a funkciou proteínovej štruktúry môžeme byť schopní doladiť aktivitu biologických katalyzátorov a vytvoriť plne syntetické analógy. Nedávna práca uvádza klonovanie prvého génu syntetického enzýmu kódujúceho aktívny fragment molekuly ribonukleázy.

III. Aplikácia proteínového inžinierstva

Technológia proteínového inžinierstva sa používa (často v kombinácii s metódou rekombinantnej DNA) na zlepšenie vlastností existujúcich proteínov (enzýmy, protilátky, bunkové receptory) a vytvorenie nových proteínov, ktoré v prírode neexistujú. Takéto proteíny sa používajú na výrobu liekov, spracovanie potravín a priemyselnú výrobu.

Niektoré vlastnosti biokatalyzátorov však spôsobujú, že ich použitie je v niektorých prípadoch neprijateľné. Napríklad väčšina enzýmov sa rozpadá, keď teplota stúpa. Vedci sa snažia prekonať takéto prekážky a zvýšiť stabilitu enzýmov v náročných výrobných podmienkach pomocou techník proteínového inžinierstva.

Okrem priemyselných aplikácií si proteínové inžinierstvo našlo svoje právoplatné miesto aj v medicínskom vývoji. Výskumníci syntetizujú proteíny, ktoré sa môžu viazať na vírusy a mutantné gény spôsobujúce nádory a urobiť ich neškodnými; vytvoriť vysoko účinné vakcíny a študovať proteíny receptorov na povrchu buniek, ktoré sú často cieľom farmaceutických liekov. Vedci zaoberajúci sa zlepšovaním potravín používajú proteínové inžinierstvo na zlepšenie kvality proteínov, ktoré uchovávajú rastlinnú potravu, ako aj želírovacích činidiel alebo zahusťovadiel.

3.1 Knižnice peptidov a epitopov

V živom organizme je väčšina biologických procesov riadená špecifickými interakciami proteín-proteín alebo proteín-nukleová kyselina. Takéto procesy zahŕňajú napríklad reguláciu génovej transkripcie pod vplyvom rôznych proteínových faktorov, interakciu proteínových ligandov s receptormi na bunkovom povrchu a špecifickú väzbu antigénov zodpovedajúcimi protilátkami. Pochopenie molekulárnych mechanizmov interakcie proteínových ligandov s receptormi má veľký zásadný a aplikovaný význam. Najmä vývoj nových liečiv proteínovej povahy zvyčajne začína identifikáciou počiatočnej aminokyselinovej sekvencie, ktorá má požadovanú biologickú aktivitu (tzv. „hlavná“ (vedúca) sekvencia). Peptidy so zásaditou sekvenciou aminokyselín však môžu mať aj nežiaduce biologické vlastnosti: nízku aktivitu, toxicitu, nízku stabilitu v organizme atď.

Pred príchodom peptidových knižníc sa zlepšovanie ich biologických vlastností uskutočňovalo sekvenčnou syntézou veľkého počtu analógov a testovaním ich biologickej aktivity, čo si vyžadovalo veľa času a peňazí. V posledných rokoch bolo možné vytvoriť tisíce rôznych peptidov v krátkom čase pomocou automatických syntetizátorov. Vyvinuté metódy miestne cielenej mutagenézy tiež umožnili dramaticky rozšíriť počet proteínov získaných súčasne a sekvenčne testovaných na biologickú aktivitu. Avšak len nedávno vyvinuté prístupy k vytváraniu peptidových knižníc viedli k produkcii miliónov aminokyselinových sekvencií potrebných na účinný skríning, aby sa medzi nimi identifikovali peptidy, ktoré najlepšie spĺňajú kritériá. Takéto knižnice sa používajú na štúdium interakcie protilátok s antigénmi, na vývoj nových inhibítorov enzýmov a antimikrobiálnych činidiel, na navrhovanie molekúl s požadovanou biologickou aktivitou alebo na udeľovanie nových vlastností proteínom, ako sú protilátky.

Knižnice peptidov sú rozdelené do troch skupín podľa spôsobov získavania. Do prvej skupiny patria knižnice získané pomocou chemickej syntézy peptidov, v ktorých sú jednotlivé peptidy imobilizované na mikronosičoch. Pri tomto prístupe po pridaní ďalších aminokyselín v jednotlivých reakčných zmesiach k peptidom imobilizovaným na mikronosičoch sa obsahy všetkých reakčných zmesí spoja a rozdelia na nové časti, ktoré sa použijú v ďalšom štádiu pridávania nových aminokyselinových zvyškov. Po sérii takýchto krokov sa syntetizujú peptidy obsahujúce sekvencie aminokyselín použitých pri syntéze vo všetkých druhoch náhodných kombinácií.

Knižnice peptidov imobilizovaných na mikronosičoch majú významnú nevýhodu: vyžadujú použitie purifikovaných receptorov v rozpustnej forme na skríning. Zároveň sa vo väčšine prípadov v biologických testoch vykonávaných pre základný a farmakologický výskum najčastejšie používajú receptory spojené s membránou. Podľa druhého spôsobu sa peptidové knižnice získavajú pomocou syntézy peptidov na pevnej fáze, pri ktorej sa v každom štádiu chemickej adície ďalšej aminokyseliny k rastúcim peptidovým reťazcom používajú ekvimolárne zmesi všetkých alebo niektorých prekurzorových aminokyselín. V konečnom štádiu syntézy sa peptidy oddelia od nosiča, t.j. ich premenou na rozpustnú formu. Tretí prístup ku konštrukcii peptidových knižníc, ktorý si teraz popíšeme, sa stal skutočným práve vďaka vývoju metód genetického inžinierstva. Dokonale ilustruje možnosti takýchto metód a je nepochybne veľkým úspechom v ich aplikácii. V tejto súvislosti uvažujme podrobnejšie o výsledkoch použitia peptidových knižníc pri štúdiu epitopov (antigénnych determinantov) proteínov.

Technológia genetického inžinierstva na získanie hybridných proteínov umožnila vyvinúť účinný spôsob výroby krátkych peptidov na analýzu ich biologickej aktivity. Rovnako ako v prípade génových knižníc, geneticky upravené peptidové knižnice predstavujú veľký (často vyčerpávajúci) súbor krátkych peptidov. Dve nedávne pozorovania umožňujú uvažovať o peptidovej knižnici súčasne s knižnicou proteínových epitopov. Po prvé, krátke peptidy môžu zahŕňať všetky hlavné aminokyselinové zvyšky, ktoré hrajú hlavnú úlohu v interakcii s protilátkami, a sú schopné napodobňovať veľké antigénne determinanty proteínov. Po druhé, vo väčšine prípadov nekovalentné väzby vytvorené medzi niekoľkými najdôležitejšími aminokyselinovými zvyškami proteínových ligandov a ich receptormi tvoria hlavný príspevok k celkovej energii interakcie ligand-receptor. S ohľadom na túto skutočnosť môže byť akýkoľvek peptid považovaný za potenciálny ligand, haptén alebo časť antigénneho determinantu väčších polypeptidov a akákoľvek knižnica peptidov môže byť považovaná za knižnicu proteínových epitopov alebo potenciálnych ligandov pre zodpovedajúce proteínové receptory.

Peptidová knižnica získaná ako výsledok implementácie tretieho prístupu v jeho modernej forme je súborom desiatok alebo dokonca stoviek miliónov krátkych odlišných aminokyselinových sekvencií, ktoré sú exprimované na povrchu bakteriofágových viriónov ako súčasť ich vlastných štruktúrne proteíny. Toto je možné vďaka zavedeniu hybridných rekombinantných génov kódujúcich zmenené štrukturálne proteíny jeho viriónov do genómu bakteriofága pomocou genetického inžinierstva. (Táto metóda je známa ako fágový displej.) V dôsledku expresie takýchto génov sa vytvárajú hybridné proteíny, na ktorých N- alebo C-konci sú ďalšie aminokyselinové sekvencie.

Knižnice peptidov a epitopov nájdu svoje uplatnenie aj pri štúdiách mechanizmov humorálnej imunitnej odpovede, ako aj chorôb imunitného systému. Najmä väčšina autoimunitných ochorení je sprevádzaná tvorbou autoprotilátok proti telu vlastným antigénom. Tieto protilátky v mnohých prípadoch slúžia ako špecifické markery pre konkrétne autoimunitné ochorenie. Pomocou epitopovej knižnice je v princípe možné získať peptidové markery, pomocou ktorých by bolo možné sledovať špecificitu autoprotilátok pri vývoji patologického procesu ako v jedinom organizme, tak aj v skupine pacientov a navyše určiť špecificitu autoprotilátok pri ochoreniach neznámej etiológie .

Knižnice peptidov a epitopov sa môžu potenciálne použiť aj na skríning imunitných sér, aby sa identifikovali peptidy, ktoré špecificky interagujú s ochrannými protilátkami. Takéto peptidy budú napodobňovať antigénne determinanty patogénnych organizmov a budú slúžiť ako ciele pre ochranné protilátky tela. To umožní použitie takýchto peptidov na očkovanie pacientov, ktorým chýbajú protilátky proti príslušným patogénom. Štúdium epitopov pomocou peptidových knižníc je špeciálnym prípadom jednej z početných oblastí ich využitia v aplikovaných a fundamentálnych štúdiách interakcie ligandov a receptorov. Ďalšie zlepšenie tohto prístupu by malo prispieť k vytvoreniu nových liečiv na báze krátkych peptidov a malo by byť užitočné pri základných štúdiách mechanizmov interakcií proteín-proteín.

3.2 Reportérové proteíny vo fúznych proteínoch

V inom prípade sa fúzne proteíny používajú na získanie vysokej úrovne expresie krátkych peptidov v bakteriálnych bunkách v dôsledku stabilizácie týchto peptidov vo fúznych proteínoch. Fúzne proteíny sa často používajú na identifikáciu a čistenie ťažko detegovateľných rekombinantných proteínov. Napríklad pripojením galaktozidázy ako reportérového proteínu na C-koniec študovaného proteínu je možné purifikovať rekombinantný proteín aktivitou galaktozidázy, stanovením jeho antigénnych determinantov imunochemickými metódami. Spojením DNA fragmentov obsahujúcich otvorené čítacie rámce (ORF) s reportérovými proteínovými génmi je možné purifikovať takéto fúzne proteíny pre reportérovú proteínovú aktivitu a použiť ich na imunizáciu laboratórnych zvierat. Výsledné protilátky sa potom použijú na purifikáciu natívneho proteínu, ktorý zahŕňa rekombinantný polypeptid kódovaný ORF, a tým identifikujú klonovaný génový fragment.

Pomocou hybridných proteínov sa rieši aj inverzný problém klonovania neznámeho génu, proti ktorého proteínovému produktu existujú protilátky. V tomto prípade je knižnica klonov nukleotidových sekvencií reprezentujúcich ORF neznámych génov skonštruovaná vo vektoroch, ktoré umožňujú spojenie klonovaného ORF v rovnakom čítacom rámci ako reportérový gén. Hybridné proteíny, ktoré sú výsledkom expresie týchto rekombinantných génov, sa identifikujú pomocou protilátok metódami enzýmovej imunoanalýzy. Hybridné gény, ktoré kombinujú vylučované proteíny a reportérové proteíny, poskytujú príležitosť na preskúmanie mechanizmov sekrécie novým spôsobom, ako aj lokalizáciu a pohyb vylučovaných proteínov v tkanivách.

3.3 Niektoré pokroky v proteínovom inžinierstve

Nahradením niekoľkých aminokyselinových zvyškov lyzozýmu bakteriofága T4 cysteínom sa získal enzým s veľkým počtom disulfidových väzieb, vďaka čomu si tento enzým zachoval svoju aktivitu aj pri vyššej teplote.

Nahradením cysteínového zvyšku serínovým zvyškom v molekule ľudského p-interferónu syntetizovaného Escherichia coli sa zabránilo tvorbe intermolekulárnych komplexov, v ktorých sa antivírusová aktivita tohto lieku znížila asi 10-krát.

Nahradenie treonínového zvyšku prolínovým zvyškom v molekule enzýmu tyrozyl-tRNA syntetázy desaťnásobne zvýšilo katalytickú aktivitu tohto enzýmu: začal rýchlo viazať tyrozín na tRNA, ktorá túto aminokyselinu počas translácie prenáša na ribozóm.

Subtilizíny sú enzýmy bohaté na serín, ktoré štiepia proteíny. Vylučujú ich mnohé baktérie a ľudia ich vo veľkej miere využívajú na biodegradáciu. Silne viažu atómy vápnika, čo zvyšuje ich stabilitu. V priemyselných procesoch však existujú chemické zlúčeniny, ktoré viažu vápnik, po ktorých subtilizíny strácajú svoju aktivitu. Zmenou génu vedci z enzýmu odstránili aminokyseliny podieľajúce sa na väzbe vápnika a nahradili jednu aminokyselinu inou, aby sa zvýšila stabilita subtilizínu. Ukázalo sa, že modifikovaný enzým je stabilný a funkčne aktívny v podmienkach blízkych priemyselným.

Ukázalo sa, že je možné vytvoriť enzým, ktorý funguje ako reštrikčné enzýmy, ktoré štiepia DNA na presne definovaných miestach. Vedci vytvorili hybridný proteín, ktorého jeden fragment rozpoznáva určitú sekvenciu nukleotidových zvyškov v molekule DNA a druhý štiepi DNA v tejto oblasti.

Aktivátor tkanivového plazminogénu je enzým, ktorý sa klinicky používa na rozpúšťanie krvných zrazenín. Bohužiaľ sa rýchlo vylučuje z obehového systému a musí sa podávať opakovane alebo vo veľkých dávkach, čo vedie k vedľajším účinkom. Zavedením troch riadených mutácií do génu tohto enzýmu sa získal dlhotrvajúci enzým so zvýšenou afinitou k degradovateľnému fibrínu a s rovnakou fibrinolytickou aktivitou ako pôvodný enzým.

Nahradením jednej aminokyseliny v molekule inzulínu vedci zabezpečili, že pri subkutánnom podávaní tohto hormónu pacientom s cukrovkou bola zmena koncentrácie tohto hormónu v krvi blízka fyziologickej, ku ktorej dochádza po jedle.

Existujú tri triedy interferónov s antivírusovou a protirakovinovou aktivitou, ale vykazujúce rozdielne špecificity. Bolo lákavé vytvoriť hybridný interferón s vlastnosťami troch typov interferónov. Boli vytvorené hybridné gény, ktoré zahŕňajú fragmenty prirodzených interferónových génov niekoľkých typov. Niektoré z týchto génov, ktoré boli integrované do bakteriálnych buniek, zabezpečili syntézu hybridných interferónov s väčšou protirakovinovou aktivitou ako majú rodičovské molekuly.

Prirodzený ľudský rastový hormón sa viaže nielen na receptor tohto hormónu, ale aj na receptor iného hormónu – prolaktínu. Aby sa predišlo nežiaducim vedľajším účinkom počas liečby, rozhodli sa vedci eliminovať možnosť naviazania rastového hormónu na prolaktínový receptor. Dosiahli to nahradením niektorých aminokyselín v primárnej štruktúre rastového hormónu pomocou genetického inžinierstva.

Pri vývoji liekov proti infekcii HIV vedci získali hybridný proteín, ktorého jeden fragment zaisťoval špecifickú väzbu tohto proteínu iba na vírusom postihnuté lymfocyty, ďalší fragment prenikol hybridným proteínom do postihnutej bunky a ďalší fragment narušil syntézu proteínov v postihnutej bunke. cele, čo viedlo k jej smrti.

Proteíny sú hlavným cieľom drog. V súčasnosti je známych asi 500 drogových cieľov. V najbližších rokoch sa ich počet zvýši na 10 000, čo umožní vznik nových, účinnejších a bezpečnejších liekov. Nedávno boli vyvinuté zásadne nové prístupy k hľadaniu liečiv: za ciele sa nepovažujú jednotlivé proteíny, ale ich komplexy, interakcie proteín-proteín a skladanie proteínov.

Záver

V súčasnosti je najpopulárnejšou aplikáciou proteínového inžinierstva modifikácia katalytických vlastností enzýmov s cieľom vyvinúť „ekologické“ priemyselné procesy. Z environmentálneho hľadiska sú enzýmy najprijateľnejšie zo všetkých katalyzátorov používaných v priemysle. To je zabezpečené schopnosťou biokatalyzátorov rozpúšťať sa vo vode a plne fungovať v prostredí s neutrálnym pH a pri relatívne nízkych teplotách. Navyše, vzhľadom na ich vysokú špecifickosť, použitie biokatalyzátorov vedie k veľmi malému počtu nežiaducich vedľajších produktov výroby. Ekologické a energeticky úsporné priemyselné procesy využívajúce biokatalyzátory sa už dlho aktívne zavádzajú v chemickom, textilnom, farmaceutickom, celulózo-papierenskom, potravinárskom, energetickom a iných oblastiach moderného priemyslu.

modifikovaná mutagenéza proteínového inžinierstva

Bibliografia

1. Proteínové inžinierstvo.

2. Proteínové inžinierstvo. Záhady genetiky. / Vyacheslav Markin // Tajomstvá, hádanky, fakty.

Proteínové inžinierstvo. // Veľká ruská encyklopédia.

Proteínové inžinierstvo. // Príručka chemika 21.

Proteínové inžinierstvo a účinnosť liekov.

Proteínové inžinierstvo. / A.I. Kornelyuk // Biopolyméry a bunky.

Proteínové inžinierstvo zvýši účinnosť liekov. // Populárna mechanika.

Proteínové inžinierstvo. Získanie inzulínu. // Biofile - vedecký informačný časopis.

Biotechnológia. Hlavné smery a úspechy. // Biológia pre uchádzačov a učiteľov.

Bogdanov A.A., Mednikov B.M. Moc nad génom / A.A. Bogdanov, B.M. Mednikov - M.: Osveta, 1989 - str.208

Genetické inžinierstvo. // Ahoj.

Gény a chemici. // Genetika.

13. Glik B., Pasternak J. Molekulárna biotechnológia. Princípy a aplikácia / B. Glick, J. Pasternak. - M.: Mir, 2002.

14. Ďalšie oblasti aplikácie genetického inžinierstva. / L.V. Timoščenko, M.V. Chubik // Medicína - novinky a technológie.

15. Egorova T.A., Klunova S.M., Zhivukhin E.A. Základy biotechnológie. / T.A. Egorová, S.M. Klunová, E.A. Zhivukhin - M., 2003.

16. Proteínové inžinierstvo. // Chémia a biotechnológia.

17. Patrushev L.I. Génová expresia / L.I. Patrushev - M.: Nauka, 2000. - 496s.

Patrushev L.I. Umelé genetické systémy. Zväzok 1: Genetické a proteínové inžinierstvo. / L.I. Patrushev - M.: Nauka, 2004. - 526 s.

Rybchin V.N. Základy genetického inžinierstva: Učebnica pre vysoké školy / V.N. Rybchin - Petrohrad: Vydavateľstvo Štátnej technickej univerzity St. Petersburg, 2002. - 522 s.

Stepanov V.M. Molekulárna biológia. Štruktúra a funkcie bielkovín. / V.M. Stepanov - M.: Vyššia škola, 1996.

Biotechnologické technológie: proteínové inžinierstvo, nanobiotechnológia, biosenzory a biočipy. / Evgenia Ryabtseva // "Komerčná biotechnológia" - online časopis.

Chernavsky D.S., Chernavskaya N.M. Proteínový stroj. Biologické makromolekulové štruktúry. / D.S. Chernavsky, N. M. Chernavskaya - M.: Vydavateľstvo Moskovskej štátnej univerzity, 1999.

Schultz G.E., Schirmer R.Kh. Princípy štruktúrnej organizácie proteínov. / G.E. Schultz, R.H. Schirmer - M.: Mir, 1982.

24. Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Proteínové inžinierstvo 20 rokov // Recenzie prírody. Molekulárna bunková biológia. 2002 Vol. 3. č. 12;

25. Proteínové inžinierstvo. // Wikipedia, slobodná encyklopédia.

Metódy genetického inžinierstva, najmä klonovanie jednotlivých génov alebo ich častí, ako aj sekvenovanie DNA, umožnili výrazne zlepšiť metodiku mutagenézy, čím sa odstránili hlavné nedostatky klasických metód indukcie mutácií v genómoch. Klasická genetická analýza predpokladá vplyv mutagénneho faktora in vivo na celý genóm, v dôsledku čoho v ňom vznikajú náhodné mutácie, často mnohopočetné, čo značne komplikuje identifikáciu mutantov. Identifikácia mutantov sa uskutočňuje podľa zmenených fenotypových znakov a povaha mutácie sa môže určiť po sekvenovaní DNA. Moderná lokalizovaná mutagenéza v skutočnosti zahŕňa reverzné akcie: najprv sa gén alebo jeho záujmový segment naklonuje, jeho štruktúra sa určí počas sekvenovania a potom sa in vitro vykonajú požadované zmeny v jeho zložení. Následky indukovanej mutácie sa zisťujú po zavedení mutantného génu do pôvodného organizmu.

Najjednoduchší variant lokalizovanej mutagenézy spočíva v ošetrení klonovaného fragmentu DNA jedným z mutagénnych faktorov, avšak takáto expozícia bude mať za následok aj náhodné zmeny v štruktúre fragmentu. Spoľahlivejšie a častejšie používané metódy lokalizovanej mutagenézy sa uskutočňujú bez použitia mutagénnych faktorov. Medzi typmi mutácií prevládajú delécie, inzercie a substitúcie nukleotidov.

vymazania. Tieto typy mutácií sú produkované endonukleázami lokalizovanou mutagenézou. Používajú sa reštriktívne aj nešpecifické endonukleázy. Najjednoduchším použitím reštrikčných enzýmov je štiepenie genómu reštrikčným enzýmom, ktorý zavádza niekoľko zlomov s tvorbou lepkavých koncov. Výsledné fragmenty sú opäť uzavreté do kruhu pomocou DNA ligázy, čo môže viesť k vytvoreniu molekúl, ktoré neobsahujú jeden zo segmentov DNA. Tento prístup vytvára veľké delécie a vo všeobecnosti sa používa v predbežných experimentoch na určenie funkcií relatívne veľkých úsekov klonovanej DNA.

Malé delécie sa získajú nasledovne. Klonovaný fragment sa štiepi vo vektore na vhodnom mieste reštrikčným enzýmom (obr. 21.1). Výsledná lineárna molekula sa ošetrí exonukleázou III, ktorá hydrolyzuje jedno vlákno v DNA,

počnúc od 3' konca. Výsledkom je súbor molekúl s jednovláknovými 5'-chvoskami rôznych dĺžok. Tieto konce sú hydrolyzované jednovláknovou DNA špecifickou S1 nukleázou a v DNA sa vytvárajú delécie. Je tiež možné použiť exonukleázu Bal 31, ktorá katalyzuje degradáciu oboch reťazcov, začínajúc od koncov lineárnych molekúl DNA. Priebeh nukleotických reakcií je regulovaný zmenou inkubačného času, teploty a koncentrácie enzýmu, čo vyvoláva tvorbu delécií rôznej dĺžky. Výsledné lineárne varianty s deléciou DNA sú často pred cyklizáciou vybavené linkermi, takže v oblasti delécie sú prítomné reštrikčné miesta. Existujú ďalšie modifikácie opísaných metód.

Vložky (vložky). Na získanie inzercií sa klonovaná DNA štiepi reštrikčným enzýmom alebo nešpecifickou endonukleázou a potom sa výsledné fragmenty ligujú v prítomnosti segmentu, ktorý sa má vložiť do DNA. Najčastejšie sa ako takéto segmenty používajú chemicky syntetizované polylinkery (kapitola 20).

Inzercie, podobne ako delécie, môžu narušiť integritu génu alebo štruktúru jeho regulačných oblastí, čo má za následok syntézu defektného proteínu (v prípade rozšírených delécií alebo posunu rámca, zvyčajne neaktívne) alebo zmeny v procese transkripcie génu. gén záujmu. Týmto spôsobom sa často získajú regulačné mutanty a skonštruujú sa exprimované vektory (kapitola 20).

Bodové mutácie . Tieto mutácie sú nukleotidové substitúcie. Na ich získanie možno použiť niekoľko prístupov: deaminácia cytozínu, zahrnutie nukleotidových analógov, nesprávne zahrnutie nukleotidov počas opravy medzery atď.

Prvý spôsob je založený na skutočnosti, že cytozínové zvyšky v jednovláknovej DNA môžu byť deaminované za vzniku uracilu pôsobením bisulfitových iónov. Jednovláknové oblasti v DNA sa zvyčajne získavajú v blízkosti reštrikčných miest, napríklad pôsobením exonukleázy III. Po ošetrení bisulfitom sa jednovláknové medzery vyplnia DNA polymerázou a konce sa ligujú. V miestach, kde sa počas deaminácie vytvoril uridylát namiesto cytidylátu, zaujme adenylát komplementárnu polohu a počas replikácie takejto molekuly bude pár GC nahradený párom AT.

Ďalším prístupom k indukcii substitúcií je ošetrenie klonovanej DNA nejakým reštrikčným enzýmom v prítomnosti etídiumbromidu, ktorý sa vkladá medzi roviny bázových párov a spôsobuje poruchy v duplexnej štruktúre. V dôsledku toho sa vytvorí iba jednovláknový zlom DNA. V mieste jednovláknového zlomu sa vytvorí malá medzera a potom sa vytvorí v prítomnosti DNA polymerázy, dATP, dGTP, dCTP a N-4-hydroxycytozíntrifosfátu namiesto dTTP. Hydroxycytozíntrifosfát je zahrnutý v reťazci namiesto tymidylátu, ale počas replikácie DNA sa rovnako dobre páruje s adenylátom aj guanylátom. V dôsledku inkorporácie guanylátu po ďalšom kole replikácie dôjde v tomto mieste k substitúcii AT → GC (obr. 21.2). Pretože pri tejto metóde sa náhrada nukleotidov uskutočňuje vo vnútri

reštrikčné miesto, je možné ľahko rozlíšiť medzi vektormi s pôvodnou sekvenciou a mutovanými. Na to stačí ošetriť ich reštrikčným enzýmom použitým v experimente: mutantné molekuly sa neštiepia.

Podobná metóda je založená na použití iba troch zo štyroch možných nukleotidov pri vypĺňaní jednovláknovej medzery DNA polymerázou. Vo väčšine prípadov sa enzým zastaví na mieste molekuly, kde narazí na komplementárny nukleotid k chýbajúcemu nukleotidu. Príležitostne sa však DNA polymeráza pomýli a obsahuje jeden z troch prítomných nukleotidov. To vedie k tvorbe kruhových molekúl, ktoré obsahujú nepárové nekomplementárne dusíkaté bázy. Keď sa takéto vektory zavedú do bakteriálnych buniek, niektoré z molekúl takéto poškodenie opravia. Výsledkom je, že v polovici molekúl sa po replikácii obnoví pôvodná sekvencia a v druhej polovici sa zafixuje mutácia. Mutantné molekuly možno rozlíšiť vyššie opísaným spôsobom.

Miestne špecifická mutagenéza. Metódy lokalizovanej mutagenézy sa vyznačujú tým, že miesta, kde dochádza k mutáciám, sú vybrané náhodne. Technika miestne špecifickej mutagenézy zároveň umožňuje zaviesť mutácie do presne definovanej oblasti génu. Toto sa uskutočňuje pomocou syntetických (získaných chemickou syntézou) oligonukleotidov s danou sekvenciou. Spôsob je vhodný v tom, že nevyžaduje prítomnosť vhodných reštrikčných miest. Metóda je založená na tvorbe heteroduplexov medzi syntetickým oligonukleotidom obsahujúcim mutáciu a komplementárnou jednovláknovou DNA vo vektore.

Postupujte nasledovne. Syntetizuje sa malý oligonukleotid (8-20 monomérov), ktorý je komplementárny k časti génu, v ktorej chcú získať mutáciu. V zložení oligonukleotidu v centrálnej oblasti je povolená jedna alebo viac nukleotidových substitúcií. Skúmaný gén alebo jeho fragment sa klonuje do vektora založeného na fágu M13, aby sa získala kruhová jednovláknová rekombinantná DNA. Produkujte zmiešanie a hybridizáciu rekombinantných vektorov s oligonukleotidmi. Oligonukleotid hybridizuje s komplementárnou oblasťou, zatiaľ čo nekomplementárne nukleotidy zostávajú nepárové. Oligonukleotid pôsobí ako primér v polymerázovej reakcii zahŕňajúcej DNA polymerázu in vitro. Krúžok je uzavretý ligázami. Výsledná kruhová molekula je zavedená do buniek E. coli, kde dochádza k čiastočnej oprave mutantných replikačných miest. Miera mutácií sa zvyčajne pohybuje od 1 do 50 %. Selekciu buniek obsahujúcich mutantné molekuly DNA je možné uskutočniť niekoľkými spôsobmi, pričom výhodou je metóda využívajúca rádioaktívne značený oligonukleotid, ktorý sa používa na mutagenézu. V tomto prípade tento nukleotid slúži ako sonda. Princíp použitia takejto sondy je založený na skutočnosti, že je plne komplementárna s mutantnou DNA a čiastočne komplementárna s DNA divokého typu. Je možné zvoliť také podmienky hybridizácie (predovšetkým teplotu), že hybridizácia značenej sondy bude stabilná len s mutantnou sekvenciou DNA, ktorú je možné detegovať rádioautografom.

Metóda miestne špecifickej mutagenézy je obzvlášť cenná, pretože umožňuje izolovať mutácie bez kontroly ich fenotypového prejavu. Táto metóda otvára nové možnosti pre štúdium funkcií génových regulačných prvkov, umožňuje meniť „silu“ promótorov, optimalizovať väzbové miesta s ribozómami atď. Jednou z hlavných aplikácií tejto metodiky je proteínové inžinierstvo.

Proteínové inžinierstvo. Táto fráza označuje súbor metodologických techník, ktoré umožňujú rekonštrukciu proteínovej molekuly cieleným zavedením vhodných mutácií do štruktúrneho génu (miestne špecifická mutagenéza) a následne požadované substitúcie aminokyselín v primárnej štruktúre proteínu.

Názorným príkladom konštrukcie aktívnejších proteínov sú experimenty Fershta a spolupracovníkov s enzýmom tyrozyl-tRNA syntetázou z baktérie Bacillus stearothermophilus. Analýza dôsledkov substitúcií aminokyselín v aktívnom centre tohto enzýmu viedla k záveru, že odstránenie skupín, ktoré tvoria slabé vodíkové väzby so substrátom, môže zlepšiť jeho afinitu k substrátu. Zistilo sa, že treonín-51 (zaberá 51. pozíciu v peptide) tvorí dlhú a slabú vodíkovú väzbu s kyslíkom ribózového kruhu, keď je naviazaný tyrozyladenylát. Zároveň sa zistilo, že prolín zaujíma rovnakú pozíciu v baktériách E. coli. Miestne špecifická mutagenéza génu, ktorý určuje štruktúru tyrozyl-tRNA syntetázy B. stearothermophilus, umožnila poskytnúť náhradu thr-51→pro-51 v peptide. V dôsledku toho sa väzba ATP v aktívnom centre enzýmu dramaticky zlepšila a jeho katalytická aktivita sa zvýšila 25-krát.

Ďalším rovnako významným príkladom proteínovej rekonštrukcie s praktickým významom je modifikácia subtilizínu z Bacillus amyloliquefaciens, uskutočnená Estelle et al. Subtilizíny sú serínové proteinázy vylučované bacilom do prostredia. Tieto enzýmy sú vyrábané vo veľkom meradle biotechnologickým priemyslom a sú široko používané v detergentných prípravkoch. Nevýhodou subtilizínov je prudký pokles proteolytickej aktivity pôsobením oxidačných činidiel, vrátane tých, ktoré sú obsiahnuté v pracích práškoch. Úlohou rekonštrukcie molekuly BPN subtilizínu bolo stabilizovať ju proti chemickej oxidácii.

V predbežných experimentoch sa zistilo, že v prítomnosti peroxidu vodíka subtilizín rýchlo znižuje aktivitu v dôsledku oxidácie zvyšku metionínu-222, ktorý sa mení na zodpovedajúci sulfoxid. Metódy miestne špecifickej mutagenézy zabezpečili nahradenie tohto metionínového zvyšku všetkými ostatnými 19 proteínovými aminokyselinami. Plazmidy s mutantnými génmi sa zaviedli do kmeňov s deléciami v zodpovedajúcich génoch a analyzovali sa vlastnosti produkovaných subtilizínov. Ukázalo sa, že mutanty so serínom a alanínom sú dostatočne stabilné voči pôsobeniu peroxidu222. Mutant obsahujúci zvyšok cysteínu-222 sa ukázal byť najaktívnejším, jeho špecifická aktivita prevyšovala špecifickú aktivitu kmeňa divokého typu o 38 %.

Podobným spôsobom bolo možné zvýšiť aktivitu b-interferónu. Medzi ďalšie úspechy proteínového inžinierstva možno menovať štúdie v objasňovaní transformačnej aktivity onkoproteínov; zmena termostability enzýmov, napríklad získanie termolabilného renínu a termostabilnej a-amylázy; zvýšenie účinnosti väzby inzulínu zodpovedajúcim plazmatickým membránovým receptorom v dôsledku nahradenia histidínu aspartátom v polohe 10 b-reťazca hormónu, ako aj mnoho ďalších príkladov. Veľké množstvo produktov proteínového inžinierstva už našlo praktické uplatnenie vo výrobných procesoch.

Bezpečnostné otázky pre kapitolu 3

MAS-selection (výber asistenta značky, výber pomocou značiek).

Zavedenie DNA do rastlinných buniek pomocou Ti- a Ri-plazmidov.

A. tumefaciens spôsobuje tvorbu nádorov na stonke dvojklíčnolistových rastlín – takzvané korunné hálky. Baktérie sa prichytia na rastlinné bunky v mieste poranenia. Zdá sa, že väzbovými miestami na bakteriálnom povrchu sú molekuly β-glukánu a O-antigénny reťazec lipopolysacharidu vonkajšej membrány.

Baktérie sa viažu na vyššie rastlinné receptory, ktoré sú tvorené bielkovinami a pektínom; lektínom v tomto prípade nezáleží. Bakteriálne väzbové miesta a rastlinné receptory sú konštitutívne; obaja partneri ich majú ešte pred momentom interakcie. Prvý krok interakcie s rastlinou – rozpoznanie – treba považovať za špecifickú priľnavosť rastlín. Akonáhle sa baktérie prichytia na povrch rastlinných buniek, začnú vytvárať celulózové vlákna. Tieto vlákna je možné vidieť pod skenovacím elektrónovým mikroskopom už 90 minút po pridaní baktérií do suspenzie bunkovej kultúry mrkvového tkaniva. Po 10 hodinách inkubácie vytvoria fibrily sieť pokrývajúcu povrch rastlinných buniek. Fibrily slúžia na pevnejšie ukotvenie baktérií na povrchu hostiteľa. Celulózové vlákna môžu byť naviazané voľne plávajúcimi bakteriálnymi bunkami. Ich fixáciou na povrchu rastliny zvyšujú fibrily početnosť infekcie. V dôsledku reprodukcie sa na povrchu rastliny vytvárajú akumulácie baktérií.

Bunková stena rastliny je poškodená v dôsledku uvoľňovania pektolytických enzýmov baktériami, čo zabezpečuje úzky kontakt medzi baktériami a plazmalemou rastlinnej bunky. Tento kontakt je nevyhnutný na prenos DNA z baktérií do rastlinnej bunky. K prenosu DNA dochádza bez narušenia celistvosti membrány rastlinnej bunky, vyžaduje si však jej určitý stav – kompetenciu.

Schopnosť A. tumefaciens indukovať nádory korunnej hálky v rastlinách koreluje s prítomnosťou Ti plazmidu v rastlinách. Nádorová transformácia sa prejavuje hypertrofiou, ku ktorej dochádza po prieniku agrobaktérií do poranených oblastí (miest) rastlín (obr. 13). Transformácia je výsledkom stabilnej kovalentnej inkorporácie (inzercie alebo integrácie) segmentu ("preneseného" alebo T-DNA) veľkého plazmidu (pTi - vyvolávajúci nádor alebo pRi - vyvolávajúci koreň) baktérií do jadrovej DNA rastlinnej bunky. .

Obrázok 10. - Genetická kolonizácia rastliny A. tumefaciens: 1- agrobaktérie existujú v rizosfére; 2 - štruktúra A. tumefaciens; 3 - integrácia T-DNA do genómu; 4 - tvorba nádoru

Iný typ agrobaktérií - A. rhizogenes - spôsobuje ochorenie nazývané "fúzatý koreň", pri ktorom sa v oblasti poškodenia koreňa tvorí množstvo nových koreňov. A. rubi zvyčajne vyvoláva neorganizované nádory (teratómy), kmene A. radiobacter sú avirulentné.

Na rozdiel od väčšiny tkanív odobratých z normálnych rastlín, transformované tkanivá v in vitro kultúre za aseptických (sterilných) podmienok sú schopné rásť neobmedzene dlho v neprítomnosti exogénne pridaných auxínov a cytokinínov. Okrem toho transformované tkanivá často syntetizujú jednu alebo viac skupín zlúčenín nazývaných opíny, ktoré sa normálne nenachádzajú v netransformovaných rastlinných tkanivách. Najpodrobnejšie boli študované nádory - korunové hálky vyvolané Agrobacterium tumefaciens. Sú to skutočne zhubné nádory, ktoré môžu rásť v kultivačnom médiu v neprítomnosti rastových stimulantov – fytohormónov nevyhnutných pre rast normálnych tkanív.

Nádory môžu byť udržiavané mnoho rokov in vitro a ak sú použité, sú schopné vyvolať nádory v zdravých rastlinách. V prirodzených podmienkach sa korunkové hálky vytvárajú na styku koreňa so stonkou (pri koreňovom krčku), z čoho pochádza aj ich názov od korunnej hálky. Korunné hálky sa však môžu vyvinúť aj na podzemných častiach rastliny, napríklad na koreňoch ovocných stromov, a nadzemných, napríklad na stonke hrozna.

V laboratóriu možno tieto choroby experimentálne vyvolať u zdravých rastlín infikovaním baktériami. Rastliny musia byť pred očkovaním poranené, pričom nádory sa vyskytujú na poškodených miestach rastliny, zvyčajne na stonke alebo listoch rastliny. Okrem celých rastlín sa ako testovacie objekty používajú explantáty, ako sú plátky mrkvy a kúsky iných rastlinných orgánov.

Tkanivá korunky obsahujú vyššie hladiny auxínu a cytokinínov. Bola odhalená ďalšia dedičná zmena v bunkách korunných hál - ide o syntézu opínov. Derivát arginínu, nezvyčajný pre rastliny, ktorý sa nachádza len v určitých nádorových líniách, bol nazvaný oktopín. Potom sa ukázalo, že iné nádorové línie syntetizujú inú zlúčeninu – nopalín, tiež derivát arginínu. V závislosti od typu opínu indukovaného v nádore dostali kmene A. tumefaciens a v nich obsiahnuté Ti plazmidy príslušné označenie - oktopín alebo nopalín.

Agrobaktérie, ktoré vyvolávajú nádory, v ktorých sa nenachádza nopalín ani oktopín, boli predtým označené ako kmene nulového typu. Neskôr sa ukázalo, že opíny tretej triedy, agropíny, sa syntetizujú v nádoroch typu nula. Našli sa aj iné typy názorov. Pretože všetky opíny sa nachádzajú iba v nádorových bunkách a chýbajú v normálnych rastlinných bunkách alebo rastlinných nádorových bunkách iných typov, možno opíny považovať za špecifické biochemické markery pre bunky korunnej žlče.

Nádory, ktoré sa vyvíjajú z jednej alebo viacerých buniek, rýchlo rastú do veľkých útvarov, ktorých priemer na určitých druhoch stromov môže dosiahnuť jeden meter. Typický neorganizovaný nádor je viac-menej okrúhla, dediferencovaná masa buniek (kalus), ktorá môže byť hladká alebo drsná, parenchymálna alebo lignifikovaná. Niekedy sa na periférii takýchto nádorov vytvárajú štruktúry v tvare listov (teratómy), niekedy adventívne korene. Často sa na infikovaných rastlinách pozorujú sekundárne nádory, ktoré sú výrazne vzdialené od primárnych. Zvyčajne sa nachádzajú nad primárnym nádorom, čo naznačuje pohyb baktérie alebo transformačného činidla v smere transpirácie.

Rozšírenie Agrobacterium a iných fytopatogénnych baktérií v medzibunkových priestoroch a xyléme je dobre dokázanou skutočnosťou. Agrobaktérie sa môžu pohybovať na veľké vzdialenosti značnou rýchlosťou. Je zrejmé, že to nie je jediný dôvod na vyvolanie sekundárnych nádorov. Organizáciu nádorov, menovite tvar, veľkosť a charakter vývoja, určujú tri faktory:

kmeň Agrobacterium,

genotyp hostiteľskej rastliny,

Fyziologický stav infikovaných rastlinných buniek.

Agrobacterium má veľmi široký rozsah hostiteľov a môže infikovať prakticky všetky dvojklíčnolistové rastliny. Dlho sa verilo, že jednoklíčnolistové rastliny nie sú náchylné na agrobakteriálnu infekciu. V súčasnosti sa ukázalo, že za určitých podmienok môžu agrobaktérie infikovať jednoklíčnolistové rastliny, najmä zástupcov čeľadí ako Amaryllidaceae, Liliaceae, Gramineae, Iridaceae a niektoré ďalšie. Existujú však určité variácie v hostiteľskom rozsahu pre rôzne kmene Agrobacterium: niektoré kmene sú schopné vyvolať hálky v určitých rastlinných druhoch, ale neinfikujú iné. Rôzne odrody tej istej rastliny môžu mať tiež rôznu citlivosť na daný bakteriálny kmeň.

Nemožnosť infekcie v prírode je spôsobená nedostatkom vhodných receptorov potrebných na interakciu s baktériami. Ďalším faktorom brániacim infekcii jednoklíčnolistových agrobaktérií môže byť neprítomnosť nízkomolekulárnych induktorov virulencie Agrobacterium v rastlinných bunkách, napríklad acetosyringónu, ktoré sú zvyčajne prítomné v bunkovej šťave pri poranení dvojklíčnolistových rastlín.

Podrobné informácie o štruktúre plazmidov Agrobacterium boli získané ich reštrikciou alebo fyzikálnym mapovaním. Výsledkom výskumu boli štyri hlavné oblasti homológie medzi oktopínovými a nopalínovými plazmidmi. Na onkogenicite sa podieľajú dve konzervované oblasti (oblasť A a D), ďalšia (B) zodpovedá oblasti kontroly replikácie plazmidov, zatiaľ čo posledná (C) kóduje konjugatívne prenosové funkcie (obr. 14).

Teda okrem T-DNA majú plazmidy oblasť kódujúcu konjugačnú funkciu (Tra), oblasť replikácie (Ori V) a oblasť virulencie (Vir). Ti-plazmidové sekvencie lemujúce T-DNA (hraničné alebo terminálne oblasti) hrajú dôležitú úlohu pri integrácii do rastlinného genómu a obsahujú nedokonalé priame opakovania s veľkosťou 24–25 bp. Delécia ľavého okraja T-DNA neovplyvňuje tvorbu nádoru, ale odstránenie pravého okraja vedie k takmer úplnej strate virulencie. Ukázalo sa, že delécia pravej repetície alebo jej časti vedie k strate schopnosti T-DNA začleniť sa do rastlinnej DNA. Vzhľadom na dôležitú úlohu koncov T-oblasti pri prenose T-DNA možno predpokladať, že akýkoľvek segment DNA vložený medzi tieto konce môže byť prenesený do rastlín ako súčasť T-DNA. Plazmidy sú modifikované takým spôsobom, aby sa odstránili všetky onkogénne sekvencie, pretože sa nezúčastňujú prenosu ani integrácie do genómu hostiteľskej bunky. Namiesto týchto génov môže byť vložená cudzia DNA a plazmid stráca svoje onkogénne vlastnosti. Neonkogénna T-DNA prítomná v regeneračných rastlinách sa prenáša podľa Mendelových zákonov. Boli vyvinuté dva spôsoby na zavedenie Ti plazmidových sekvencií obsahujúcich požadovaný gén do rastliny.

Obrázok 11. - Štruktúra Ti-plazmidov nopalínového a oktopínového typu

Prvá metóda - metóda "intermediate vectors" (kointegračné vektory) - je založená na použití plazmidu E. coli pBR 322 (obr. 15). T-DNA sa odštiepi z Ti plazmidu reštrikčnými enzýmami a vloží sa do plazmidu pBR 322 na klonovanie do E. coli. Baktérie obsahujúce T-DNA plazmid sa rozmnožia a plazmid sa izoluje. Požadovaný gén sa potom vloží do klonovanej T-DNA pomocou reštrikčných enzýmov. Táto rekombinantná molekula obsahujúca T-DNA s vloženým génom sa opäť rozmnožuje vo veľkom množstve, to znamená klonuje sa do Escherichia coli. Potom sa pomocou konjugácie zavedú do buniek agrobaktérií nesúcich kompletný Ti-plazmid.

K homológnej rekombinácii dochádza medzi T segmentmi natívneho Ti plazmidu a intermediárnym vektorom. Výsledkom je, že T-DNA s vloženým génom je zahrnutá v natívnom Ti-plazmide a nahrádza normálnu DNA. Získajú sa bunky A. tumefaciens nesúce Ti-plazmidy s potrebnými génmi zabudovanými do T-segmentu. Ďalej sa ich prenos do rastlinných buniek uskutočňuje obvyklým spôsobom, charakteristickým pre agrobaktérie.

Obrázok 12. - Vytvorenie kointegračného vektora na báze Ti-plazmidu: PP - štiepenie reštrikčnými enzýmami

Druhá metóda je založená na vytvorení systému binárnych (dvojitých) vektorov.

Nedávne štúdie ukázali, že na infekciu a transformáciu nie je potrebný celý Ti-plazmid, ale postačujú len okrajové oblasti T-DNA a jedna oblasť Ti-plazmidu zodpovedná za virulenciu. Navyše tieto dve oblasti DNA nemusia byť v rovnakom plazmide. Ak agrobakteriálne bunky obsahujú Ti-plazmid s virovým segmentom a ďalší T-DNA plazmid, tieto baktérie môžu transformovať rastlinné bunky. Súčasne sa T-DNA s akýmikoľvek génmi v nej zabudovanými integruje s rastlinným genómom, čo si nevyžaduje homológnu rekombináciu v bakteriálnych bunkách. Na uskutočnenie expresie cudzích génov je potrebný špecifický promótor T-DNA, napríklad promótor nopalínsyntetázy.

Ukázalo sa, že funguje v rastlinných bunkách a možno ho ľahko spojiť s kódujúcou sekvenciou cudzieho génu v rozšírených subklonoch Ti plazmidu. Ďalšou výhodou tohto promótora je, že funguje v kalusoch a vo väčšine rastlinných orgánov. Účinnosť transformácie pomocou modifikovanej T-DNA agrobaktérií je v súčasnosti lepšia ako všetky ostatné spôsoby prenosu génov do rastliny.

O mechanizmoch, ktorými agrobaktéria prenáša T-DNA rastlinného jadra, je známe veľmi málo: T-segmenty DNA oktopínových a nopalínových plazmidov sú vložené do rôznych, zdanlivo náhodných bodov na hostiteľských chromozómoch, ale nikdy sa integrovať s mitochondriálnou DNA a chloroplastmi.

Na zavedenie upravených Ti plazmidov do rastlinnej bunky možno použiť niekoľko metód. Najjednoduchšou z týchto prirodzených metód je očkovanie umelých kmeňov do poškodených (zranených) oblastí rastliny.

Ďalšou metódou je transformácia protoplastov ich spoločnou kultiváciou s agrobaktériami. Techniku kokultivácie možno považovať za indukciu nádoru v umelých podmienkach: virulentné agrobaktérie sa dočasne kokultivujú s protoplastmi. Ak sa agrobaktérie pridajú k čerstvo izolovaným alebo jeden deň starým protoplastom, nepozoruje sa ani prichytenie ani transformácia baktérií. Nevyhnutnou podmienkou transformácie je prítomnosť novovytvorených bunkových stien v 3-dňových protoplastoch. Potvrdzuje to použitie inhibítorov tvorby bunkovej steny, ktoré tiež inhibujú prichytenie baktérií. Po období spoločnej kultivácie (viac ako deň), počas ktorého dochádza k agregácii protoplastov s baktériami, sa voľné baktérie odstránia opakovaným premývaním. Ďalej sa rastlinné bunky kultivujú na médiu s prídavkom hormónov a po 3 až 4 týždňoch sa malé kolónie vysievajú na médium bez hormónov. Na tomto médiu prežívajú iba kolónie transformovaných buniek.

Takto boli získané transformované rastliny tabaku a petúnie regenerované. Táto metóda umožňuje výrazne rozšíriť okruh hostiteľov agrobaktérií, vrátane druhov z čeľade obilnín. Účinnosť kokultivácie možno zvýšiť použitím induktorov bunkovej fúzie (PEG, vápnik atď.).

Transformácia protoplastov sa môže uskutočňovať aj ich spoločnou kultiváciou priamo s Ti-plazmidmi; takéto experimenty sa uskutočňovali s protoplastmi petúnie a tabaku. Veľmi nízka účinnosť inkorporácie T-DNA do protoplastov pozorovaná v prvých experimentoch bola potom zvýšená chemickou stimuláciou (PEG). Z transformovaných buniek sa získali transgénne rastliny. Výhodou tejto metódy je, že nie sú potrebné stredné vektory. Úspechy v genetickom inžinierstve rastlín

Prvé transgénne rastliny (rastliny tabaku s vloženými génmi z mikroorganizmov) boli získané v roku 1983. Prvé úspešné poľné pokusy s transgénnymi rastlinami (rastliny tabaku odolné voči vírusovej infekcii) sa uskutočnili v USA už v roku 1986.

Po absolvovaní všetkých potrebných testov na toxicitu, alergénnosť, mutagenitu atď. Prvé transgénne produkty boli komercializované v USA v roku 1994. Boli to paradajky Flavr Savr od Calgenu s oneskoreným dozrievaním a sójové bôby Monsanto odolné voči herbicídom. Už po 1-2 rokoch uvádzajú biotechnologické spoločnosti na trh množstvo geneticky modifikovaných rastlín: paradajky, kukuricu, zemiaky, tabak, sóju, repku, drene, reďkovky, bavlnu.

V súčasnosti sa na získavaní a testovaní geneticky modifikovaných rastlín podieľajú stovky komerčných firiem po celom svete s celkovým kapitálom viac ako sto miliárd dolárov. V roku 1999 boli transgénne rastliny vysadené na celkovej ploche asi 40 miliónov hektárov, čo je viac ako rozloha krajiny ako Spojené kráľovstvo. V USA geneticky modifikované plodiny (GM plodiny) v súčasnosti predstavujú približne 50 % plodín kukurice a sóje a viac ako 30 – 40 % plodín bavlny. To naznačuje, že geneticky upravená rastlinná biotechnológia sa už stala dôležitým odvetvím na výrobu potravín a iných užitočných produktov, ktoré priťahuje značné ľudské zdroje a finančné toky. V najbližších rokoch sa očakáva ďalší rýchly nárast plochy, ktorú zaberajú transgénne formy kultúrnych rastlín.

Prvá vlna transgénnych rastlín schválených na praktické použitie obsahovala ďalšie gény pre odolnosť (voči chorobám, herbicídom, škodcom, znehodnoteniu počas skladovania a stresom).

Súčasná etapa vývoja rastlinného genetického inžinierstva bola nazvaná „metabolické inžinierstvo“. Úlohou pritom nie je ani tak zlepšiť určité existujúce vlastnosti rastliny ako pri tradičnom šľachtení, ale naučiť rastlinu produkovať úplne nové zlúčeniny používané v medicíne, chemickej výrobe a iných oblastiach. Týmito zlúčeninami môžu byť napríklad špeciálne mastné kyseliny, prospešné proteíny s vysokým obsahom esenciálnych aminokyselín, modifikované polysacharidy, jedlé vakcíny, protilátky, interferóny a iné „drogové“ proteíny, nové polyméry šetrné k životnému prostrediu a mnoho, oveľa viac. Použitie transgénnych rastlín umožňuje zaviesť rozsiahlu a lacnú produkciu takýchto látok a tým ich urobiť dostupnejšími pre širokú spotrebu.

Zlepšenie kvality zásobných bielkovín

Zásobné proteíny hlavných kultivovaných druhov sú kódované rodinou blízko príbuzných génov. Akumulácia zásobných proteínov semien je komplexný biosyntetický proces. Prvý pokus genetického inžinierstva zlepšiť vlastnosti jednej rastliny zavedením génu zásobného proteínu z inej rastliny uskutočnili D. Kemp a T. Hall v roku 1983 v USA. Gén fazuľového fázolínu sa preniesol do slnečnicového genómu pomocou Ti plazmidu. Výsledkom tohto experimentu bola iba chimérická rastlina, nazývaná sanbin. Imunologicky príbuzné fazolínové polypeptidy sa našli v slnečnicových bunkách, čo potvrdilo fakt prenosu génov medzi rastlinami patriacimi do rôznych čeľadí

Neskôr sa fazeolínový gén preniesol do tabakových buniek: v regenerovaných rastlinách sa gén exprimoval vo všetkých tkanivách, aj keď v malom množstve. Nešpecifická expresia fazeolínového génu, ako v prípade jeho prenosu do slnečnicových buniek, je veľmi odlišná od expresie tohto génu v zrelých kotyledónoch fazule, kde fazeolín tvoril 25-50 % z celkového proteínu. Táto skutočnosť poukazuje na potrebu zachovania ďalších regulačných signálov tohto génu pri konštrukcii chimérických rastlín a na dôležitosť kontroly génovej expresie v procese ontogenézy rastlín.

Gén kódujúci kukuričný zásobný proteín, zeín, bol po jeho integrácii do T-DNA prenesený do slnečnicového genómu nasledovne. Kmene Agrobacterium obsahujúce Ti plazmidy s génom pro zeín boli použité na vyvolanie nádorov v stonkách slnečnice. Niektoré zo získaných nádorov obsahovali mRNA syntetizovanú z génov kukurice, čo dáva dôvod považovať tieto výsledky za prvý dôkaz transkripcie jednoklíčnolistového génu do dvojklíčnolistovej rastliny. Prítomnosť zeínového proteínu v tkanivách slnečnice však nebola zistená.

Reálnejšou úlohou genetického inžinierstva je zlepšiť zloženie aminokyselín v proteínoch. Ako je známe, v zásobnej bielkovine väčšiny obilnín je nedostatok lyzínu, treonínu, tryptofánu, v strukovinách - metionínu a cysteínu. Zavedenie ďalších množstiev deficitných aminokyselín do týchto proteínov by mohlo odstrániť nerovnováhu aminokyselín. Tradičnými metódami šľachtenia sa podarilo výrazne zvýšiť obsah lyzínu v zásobných bielkovinách obilnín. Vo všetkých týchto prípadoch bola časť prolamínov (v alkohole rozpustných zásobných proteínov obilnín) nahradená inými proteínmi obsahujúcimi veľa lyzínu. V takýchto rastlinách sa však zrnitosť zmenšila a úroda sa znížila. Na tvorbu normálneho zrna sú zrejme potrebné prolamíny a ich nahradenie inými bielkovinami negatívne ovplyvňuje úrodu. Vzhľadom na túto okolnosť je na zlepšenie kvality zásobnej bielkoviny zrna potrebný proteín, ktorý má nielen vysoký obsah lyzínu a treonínu, ale dokáže plne nahradiť určitú časť prolamínov pri tvorbe zrna.

Rastliny dokážu produkovať aj živočíšne bielkoviny. Vloženie chimérického génu pozostávajúceho z časti génu Arabidopsis 25-proteín a kódujúcej časti pre neuropeptid enkefalín do genómu Arabidopsis thaliana a Brassica napus teda viedlo k syntéze chimérického proteínu až do 200 ng na 1 g. osiva. Dve štrukturálne proteínové domény boli spojené sekvenciou rozpoznávanou trypsínom, čo umožnilo ďalej jednoducho izolovať čistý enkefalín.

V ďalšom experimente sa po krížení transgénnych rastlín, z ktorých do jednej bol vložený gén pre gama podjednotku a v druhom, gén pre kappa podjednotku imunoglobulínu, podarilo získať expresiu oboch reťazcov u potomstva. Výsledkom bolo, že rastlina vytvorila protilátky, ktoré tvorili až 1,3 % celkového proteínu listov. Tiež sa ukázalo, že plne funkčné sekrečné monoklonálne imunoglobulíny môžu byť zostavené v tabakových rastlinách. Sekrečné imunoglobulíny sa zvyčajne vylučujú do ústnej dutiny a žalúdka ľudí a zvierat a slúžia ako prvá bariéra proti črevným infekciám. Vo vyššie uvedenej práci boli monoklonálne protilátky produkované v rastlinách, ktoré boli špecifické pre Streptococcus mutans, baktérie spôsobujúce zubný kaz. Predpokladá sa, že na základe takýchto monoklonálnych protilátok produkovaných transgénnymi rastlinami bude možné vytvoriť skutočne zubnú pastu proti zubnému kazu. Z ďalších živočíšnych proteínov medicínskeho záujmu bola preukázaná produkcia ľudského β-interferónu v rastlinách.

Boli vyvinuté aj prístupy na získanie bakteriálnych antigénov v rastlinách a ich použitie ako vakcín. Získali sa oligoméry netoxickej p-toxínovej podjednotky cholery exprimujúce zemiaky. Tieto transgénne rastliny by sa mohli použiť na výrobu lacnej vakcíny proti cholere.

Tuky

Mastné kyseliny, hlavná zložka rastlinného oleja, sú najdôležitejšou surovinou na získavanie rôznych druhov chemikálií. Vo svojej štruktúre ide o uhlíkové reťazce, ktoré majú rôzne fyzikálno-chemické vlastnosti v závislosti od ich dĺžky a stupňa nasýtenia uhlíkových väzieb. V roku 1995 bolo ukončené experimentálne overovanie a bolo získané povolenie od federálnych úradov USA na pestovanie a komerčné využitie transgénnych rastlín repky olejnej s upraveným zložením rastlinného oleja, vrátane, spolu s konvenčnými 16- a 18-člennými mastnými kyselinami, aj do 45 % 12-členných mastných kyselín.- laureát. Táto látka je široko používaná na výrobu pracích práškov, šampónov a kozmetiky.

Experimentálna práca spočívala v tom, že špecifický gén pre tioesterázu bol klonovaný z rastliny Umbellularia califomica, kde obsah laurátu v tuku semena dosiahol 70 %. Štrukturálna časť génu tohto enzýmu pod kontrolou promótora-terminátora proteínového génu špecifického pre skoré štádium tvorby semien bola vložená do genómu repky a Arabidopsis, čo viedlo k zvýšeniu obsahu laurát v oleji týchto rastlín.

Z ďalších projektov súvisiacich so zmenou zloženia mastných kyselín možno spomenúť práce zamerané na zvýšenie alebo zníženie obsahu nenasýtených mastných kyselín v rastlinnom oleji. Zaujímavé sú experimenty s kyselinou petroselínovou, izomérom kyseliny olejovej, kde je dvojitá väzba za šiestym uhlíkovým členom. Táto mastná kyselina je súčasťou zloženia koriandrového oleja a určuje jeho vyššiu teplotu topenia (33°C), zatiaľ čo v prítomnosti kyseliny olejovej je teplota topenia iba 12°C. Predpokladá sa, že po prenose génov, ktoré určujú syntézu kyseliny petroselínovej do rastlín – producentov rastlinného oleja, bude možné vyrábať diétny margarín s obsahom nenasýtenej mastnej kyseliny. Okrem toho je veľmi jednoduché získať laurát z kyseliny petroselínovej oxidáciou ozónom. Ďalšie štúdium špecifík biochemickej syntézy mastných kyselín zrejme povedie k schopnosti kontrolovať túto syntézu s cieľom získať mastné kyseliny rôznych dĺžok a stupňov nasýtenia, čo výrazne zmení výrobu čistiacich prostriedkov, kozmetiky, cukroviniek. , tvrdidlá, mazivá, liečivá, polyméry. , motorová nafta a mnohé ďalšie, čo je spojené s využívaním uhľovodíkových surovín.

Polysacharidy

Pracuje sa na vytvorení transgénnych rastlín zemiakov a iných plodín akumulujúcich škrob, v ktorých bude táto látka hlavne vo forme amylopektínu, teda rozvetvenej formy škrobu, alebo hlavne len vo forme amylózy, teda lineárnej formy škrobu. Roztok amylopektínu vo vode je tekutejší a transparentnejší ako amylóza, ktorá pri interakcii s vodou vytvára tuhý gél. Takže napríklad škrob, pozostávajúci hlavne z amylopektínu, bude pravdepodobne žiadaný na trhu výrobcov rôznych výživových zmesí, kde sa v súčasnosti ako plnivo používa modifikovaný škrob. Genómy plastidov a mitochondrií môžu tiež prejsť genetickou modifikáciou. Takéto systémy môžu významne zvýšiť obsah produktu v transgénnom materiáli.

Vytváranie rastlín odolných voči herbicídom

V nových, intenzívnych poľnohospodárskych technológiách sa herbicídy používajú veľmi široko. Súvisí to s tým. že niekdajšie environmentálne nebezpečné širokospektrálne herbicídy, ktoré sú toxické pre cicavce a dlhodobo pretrvávajú vo vonkajšom prostredí, sa nahrádzajú novými, vyspelejšími a bezpečnejšími zlúčeninami. Majú však nevýhodu - inhibujú rast nielen burín, ale aj kultúrnych rastlín. Také vysoko účinné herbicídy, ako je glyfosát, atrazín, sa intenzívne študujú, aby sa identifikoval mechanizmus tolerancie niektorých burín k nim. Na poliach, kde je atrazín široko používaný, sa biotypy rezistentné voči atrazínu často objavujú v mnohých rastlinných druhoch.

Štúdium mechanizmu rezistencie voči herbicídu s cieľom získať kultivované rastliny s týmto znakom pomocou genetického inžinierstva zahŕňa nasledujúce kroky: identifikácia biochemických cieľov účinku herbicídu v rastlinnej bunke, selekcia organizmov odolných voči danému herbicídu ako zdrojov génov rezistencie; klonovanie týchto génov, ich zavedenie do kultúrnych rastlín a štúdium ich fungovania

Existujú štyri zásadne odlišné mechanizmy, ktoré môžu poskytnúť odolnosť voči určitým chemickým zlúčeninám, vrátane herbicídov: transport, eliminácia, regulácia a kontakt. Transportný mechanizmus rezistencie spočíva v nemožnosti prieniku herbicídu do bunky. Pôsobením eliminačného mechanizmu rezistencie môžu byť látky, ktoré sa dostali do bunky, zničené pomocou indukovateľných bunkových faktorov, najčastejšie degradujúcich enzýmov, a tiež podstúpiť ten či onen typ modifikácie za vzniku neaktívnych produktov, ktoré sú pre organizmus neškodné. bunka. Pri regulačnej rezistencii sa začne intenzívne syntetizovať proteín alebo bunkový enzým, ktorý je inaktivovaný pôsobením herbicídu, čím sa eliminuje nedostatok požadovaného metabolitu v bunke. Kontaktný mechanizmus rezistencie je zabezpečený zmenou štruktúry cieľa (proteínu alebo enzýmu), ktorej interakcia je spojená s poškodzujúcim účinkom herbicídu.

Zistilo sa, že znak odolnosti voči herbicídom je monogénny, to znamená, že znak je najčastejšie určený jedným génom. To značne uľahčuje možnosť použitia technológie rekombinantnej DNA na prenos tohto znaku. Gény kódujúce rôzne enzýmy degradujúce a modifikujúce herbicídy možno úspešne použiť na vytvorenie rastlín odolných voči herbicídom pomocou genetického inžinierstva.

Tradičné šľachtiteľské metódy na vytváranie odrôd odolných voči herbicídom sú veľmi, časovo náročné a neúčinné. V zahraničí najpoužívanejší herbicíd glyfosát (obchodný názov Roundup) inhibuje syntézu najdôležitejších aromatických aminokyselín pôsobením na enzým 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntázu (EPSP-syntáza). Známe prípady rezistencie na tento herbicíd sú spojené buď so zvýšením úrovne syntézy tohto enzýmu (regulačný mechanizmus), alebo s objavením sa mutantného enzýmu necitlivého na glyfosfát (kontaktný mechanizmus). Gén EPSP syntázy bol izolovaný z rastlín rezistentných na glyfosfát a umiestnený pod promótor vírusu karfiolovej mozaiky. Pomocou Ti plazmidu sa tento genetický konštrukt zaviedol do buniek petúnie. V prítomnosti jednej kópie génu v rastlinách regenerovaných z transformovaných buniek sa enzým syntetizoval 20–40-krát viac ako v pôvodných rastlinách, ale rezistencia na glyfosfát sa zvýšila iba 10-krát.

Atrazín je jedným z najbežnejších herbicídov používaných pri ošetrovaní plodín. Inhibuje fotosyntézu väzbou na jeden z proteínov fotosystému II a zastavením transportu elektrónov. Odolnosť voči herbicídu je výsledkom bodových mutácií tohto proteínu viažuceho plastochinón (náhrada serínu glycínom), v dôsledku čoho stráca schopnosť interagovať s herbicídom. V mnohých prípadoch bolo možné preniesť mutantný proteínový gén do rastlín citlivých na atrazín pomocou Ti plazmidu. Gén rezistencie integrovaný do rastlinného chromozómu bol vybavený signálnou sekvenciou, ktorá zaisťovala transport syntetizovaného proteínu do chloroplastov. Chimérické rastliny vykazovali významnú rezistenciu voči koncentráciám atrazínu, ktoré spôsobili smrť kontrolných rastlín s génom divého typu proteínu. Niektoré rastliny sú schopné inaktivovať atrazín odštiepením chlórového zvyšku enzýmom glutatión-S-transferázou. Ten istý enzým inaktivuje aj iné príbuzné herbicídy z triazínového radu (propazín, simazín atď.).

Existujú rastliny, ktorých prirodzená odolnosť voči herbicídom je založená na detoxikácii. Rezistencia rastlín voči chlórsulfurónu teda môže byť spojená s deaktiváciou molekuly herbicídu jej hydroxyláciou a následnou glykozyláciou zavedenej hydroxylovej skupiny. Vývoj rastlín odolných voči patogénom a škodcom Rezistencia rastlín voči rôznym patogénom je najčastejšie komplexný multigénový znak.

Súčasný prenos viacerých lokusov je náročný aj metódami genetického inžinierstva, nehovoriac o klasických selekčných metódach. Iný spôsob je jednoduchší. Je známe, že metabolizmus sa v odolných rastlinách pri napadnutí patogénmi mení. Akumulujú sa zlúčeniny ako H2O2, kyselina salicylová, fytoallexíny. Zvýšená hladina týchto zlúčenín prispieva k odolnosti rastliny v boji proti patogénom.

Tu je jeden príklad dokazujúci úlohu kyseliny salicylovej v imunitnej odpovedi rastlín. Transgénne rastliny tabaku, ktoré obsahujú bakteriálny gén, ktorý riadi syntézu salicyláthydrolázy (tento enzým rozkladá kyselinu salicylovú), neboli schopné vyvolať imunitnú odpoveď. Preto geneticky upravená zmena hladiny kyseliny salicylovej alebo produkcie v rastlinách v reakcii na patogén H2O2 môže byť sľubná pre vytvorenie rezistentných transgénnych rastlín.

Vo fytovirológii je fenomén indukovanej krížovej rezistencie rastlín voči vírusovým infekciám všeobecne známy. Podstatou tohto javu je, že infekcia rastliny jedným kmeňom vírusu zabráni následnej infekcii týchto rastlín iným kmeňom vírusu. Molekulárny mechanizmus potlačenia vírusovej infekcie je stále nejasný. Ukázalo sa, že na imunizáciu rastlín postačuje zavedenie jednotlivých vírusových génov, napríklad génov pre kapsidové proteíny. Gén pre obalový proteín vírusu tabakovej mozaiky sa teda preniesol do tabakových buniek a získali sa transgénne rastliny, v ktorých 0,1 % všetkých listových proteínov predstavoval vírusový proteín. Značná časť týchto rastlín pri infikovaní vírusom nevykazovala žiadne príznaky choroby. Je možné, že vírusový obalový proteín syntetizovaný v bunkách bráni vírusovej RNA normálne fungovať a vytvárať plnohodnotné vírusové častice. Zistilo sa, že expresia kapsidového proteínu vírusu tabakovej mozaiky, vírusu mozaiky lucerny, vírusu mozaiky uhoriek, X-vírusu zemiakov v zodpovedajúcich transgénnych rastlinách (tabak, paradajky, zemiaky, uhorky, paprika) poskytuje vysokú úroveň ich ochrana pred následnou vírusovou infekciou. Navyše u transformovaných rastlín nedošlo k zníženiu plodnosti, nežiaducim zmenám v raste a fyziologických vlastnostiach pôvodných exemplárov a ich potomstva. Predpokladá sa, že indukovaná rezistencia rastlín voči vírusom je spôsobená špeciálnym antivírusovým proteínom, veľmi podobným živočíšnemu interferónu. Zdá sa, že genetickým inžinierstvom je možné zvýšiť expresiu génu kódujúceho tento proteín jeho amplifikáciou alebo jeho nahradením silnejším promótorom.

Treba poznamenať, že použitie genetického inžinierstva na ochranu rastlín pred rôznymi patogénnymi mikroorganizmami je do značnej miery brzdené nedostatkom vedomostí o mechanizmoch obranných reakcií rastlín. Insekticídy sa používajú na kontrolu hmyzích škodcov v rastlinnej výrobe. Na cicavce však pôsobia škodlivo, zabíjajú užitočný hmyz, znečisťujú životné prostredie, cesty a okrem toho sa im hmyz rýchlo prispôsobuje. Je známe, že viac ako 400 druhov hmyzu je odolných voči používaným insekticídom. Biologické prostriedky kontroly preto priťahujú čoraz väčšiu pozornosť, poskytujú prísnu selektivitu pôsobenia a nedostatočnú adaptáciu škodcov na aplikovaný biopesticíd.

O baktérii Bacillus thuringiensis je už dlho známe, že produkuje proteín, ktorý je veľmi toxický pre mnohé druhy hmyzu a zároveň bezpečný pre cicavce. Proteín (delta-endotoxín, CRY proteín) je produkovaný rôznymi kmeňmi B. thuringiensis. Interakcia toxínu s receptormi je prísne špecifická, čo komplikuje výber kombinácie toxín-hmyz. V prírode sa našlo veľké množstvo kmeňov B. thuringiensis, ktorých toxíny pôsobia len na určité druhy hmyzu. Prípravky B. thuringiensis sa už desaťročia používajú na ničenie hmyzu na poliach. Bezpečnosť toxínu a jeho základných bielkovín pre ľudí a iné cicavce bola plne preukázaná. Vloženie génu tohto proteínu do rastlinného genómu umožňuje získať transgénne rastliny, ktoré hmyz nezožerie.

Okrem druhovej špecifickosti z hľadiska ich účinku na hmyz neviedla inzercia prokaryotických génov delta-toxínu do rastlinného genómu ani pod kontrolou silných eukaryotických promótorov k vysokej úrovni expresie. Pravdepodobne tento jav vznikol v dôsledku skutočnosti, že tieto bakteriálne gény obsahujú podstatne viac adenínových a tymínových nukleotidových báz ako rastlinná DNA. Tento problém bol vyriešený vytvorením modifikovaných génov, kde boli určité fragmenty vystrihnuté a pridané z prirodzeného génu, pričom boli zachované domény kódujúce aktívne časti delta toxínu. Takýmito prístupmi sa získali napríklad zemiaky odolné voči pásavke zemiakovej. Boli získané transgénne rastliny tabaku schopné syntetizovať toxín. Takéto rastliny boli necitlivé na húsenice Manduca sexta. Ten zomrel do 3 dní po kontakte s rastlinami produkujúcimi toxíny. Tvorba toxínov a z toho vyplývajúca odolnosť voči hmyzu bola dedená ako dominantná vlastnosť.

V súčasnosti tvoria takzvané Bt rastliny (z B. thuringiensis) bavlny a kukurice prevažnú časť celkového množstva geneticky modifikovaných rastlín týchto plodín, ktoré sa pestujú na poliach Spojených štátov amerických.

V súvislosti s možnosťami genetického inžinierstva navrhnúť entomopatogénne rastliny na báze toxínu mikrobiálneho pôvodu sú toxíny rastlinného pôvodu ešte väčšie. Fytotoxíny sú inhibítory syntézy bielkovín a plnia ochrannú funkciu proti hmyzím škodcom mikroorganizmov a vírusov. Najlepšie z nich je ricín, syntetizovaný v ricínových bôboch: jeho gén bol klonovaný a nukleotidová sekvencia bola stanovená. Vysoká toxicita ricínu pre cicavce však obmedzuje prácu genetického inžinierstva s ním len na priemyselné plodiny, ktoré sa nepoužívajú na ľudskú výživu a krmivo pre zvieratá. Toxín produkovaný American Phytolacca je účinný proti vírusom a je pre zvieratá neškodný. Jeho mechanizmus účinku spočíva v inaktivácii vlastných ribozómov, keď do buniek vstúpia rôzne patogény vrátane fytovírusov. Postihnuté bunky sa stávajú nekrotickými, čím bránia patogénu v množení a šírení po celej rastline. V súčasnosti prebiehajú štúdie zamerané na štúdium génu pre tento proteín a jeho prenos do iných rastlín.

Vírusové choroby sú medzi hmyzom rozšírené, takže na ničenie hmyzích škodcov možno použiť prírodné hmyzie vírusy, ktorých prípravky sa nazývajú vírusové pesticídy. Na rozdiel od pesticídov majú úzke spektrum účinku, nezabíjajú užitočný hmyz, v prostredí sa rýchlo ničia a nie sú nebezpečné pre rastliny a živočíchy. Spolu s vírusmi hmyzu sa ako biopesticídy používajú aj niektoré huby, ktoré infikujú hmyzích škodcov. V súčasnosti používané biopesticídy sú prírodnými kmeňmi entomopatogénnych vírusov a húb, ale v budúcnosti nie je vylúčená možnosť vytvorenia nových účinných biopesticídov metódami genetického inžinierstva.

Zvýšenie odolnosti rastlín voči stresovým podmienkam

Rastliny sú veľmi často vystavované rôznym nepriaznivým environmentálnym faktorom: vysokým a nízkym teplotám, nedostatku vlahy, zasoleniu pôdy a plynovej kontaminácii prostredia, nedostatku alebo naopak nadbytku niektorých minerálov a pod.. Týchto faktorov je veľa, preto Spôsoby ochrany proti nim sú rôznorodé - od fyziologických vlastností až po štrukturálne úpravy na prekonanie ich škodlivých účinkov.

Odolnosť rastlín voči určitému stresovému faktoru je výsledkom vplyvu mnohých rôznych génov, preto nie je potrebné hovoriť o úplnom prenose znakov tolerancie z jedného rastlinného druhu na druhý metódami genetického inžinierstva. Napriek tomu existujú určité príležitosti pre genetické inžinierstvo na zlepšenie odolnosti rastlín. Týka sa to práce s jednotlivými génmi, ktoré riadia metabolické reakcie rastlín na stresové podmienky, napríklad nadprodukciu prolínu v reakcii na osmotický šok, salinitu, syntézu špecifických proteínov v reakcii na tepelný šok atď. Ďalšie hĺbkové štúdium fyziologických , biochemický a genetický základ Reakcia rastliny na podmienky prostredia nepochybne umožní použitie metód genetického inžinierstva na konštrukciu odolných rastlín.

Zatiaľ možno zaznamenať iba nepriamy prístup k získaniu mrazuvzdorných rastlín na základe genetických manipulácií s Pseudomonas syringae. Tento mikroorganizmus, koexistujúci s rastlinami, prispieva k ich poškodeniu skorými mrazmi.Mechanizmus javu je spôsobený tým, že bunky mikroorganizmu syntetizujú špeciálny proteín, ktorý je lokalizovaný vo vonkajšej membráne a je centrom kryštalizácie ľadu. Je známe, že tvorba ľadu vo vode závisí od látok, ktoré môžu slúžiť ako centrá tvorby ľadu. Proteín, ktorý spôsobuje tvorbu ľadových kryštálikov v rôznych častiach rastliny (listy, stonky, korene), je jedným z hlavných faktorov zodpovedných za poškodenie pletív rastlín náchylných na skoré mrazy. Početné pokusy za prísne kontrolovaných podmienok ukázali, že sterilné rastliny nepoškodili mrazy do -6-8°C, kým rastliny s príslušnou mikroflórou boli poškodené už pri teplotách -1,5-2°C. Mutanty týchto baktérií, tzv. ktorá stratila schopnosť syntetizovať proteín, ktorý spôsobuje tvorbu ľadových kryštálov, nezvýšila teplotu tvorby ľadu a rastliny s takouto mikroflórou boli odolné voči mrazu. Kmeň takýchto baktérií, nastriekaný na hľuzy zemiakov, konkuroval bežným baktériám, čo viedlo k zvýšeniu mrazuvzdornosti rastlín. Je možné, že takéto baktérie, vytvorené pomocou metód genetického inžinierstva a používané ako súčasť vonkajšieho prostredia, poslúžia na boj proti mrazom.

Zvýšenie účinnosti biologickej fixácie dusíka

Enzým zodpovedný za redukciu molekulárneho dusíka na amónium bol dobre študovaný. - dusitanáza. Štruktúra dusíkatej látky je rovnaká vo všetkých organizmoch viažucich dusík. Počas fixácie dusíka je nevyhnutnou fyziologickou podmienkou ochrana dusíkatej látky pred deštrukciou kyslíkom. Najlepšie preštudované medzi fixátormi dusíka sú rizóbie, ktoré tvoria symbiózu so strukovinami a voľne žijúcou baktériou Klebsiella pneumoniae. Zistilo sa, že za fixáciu dusíka v týchto baktériách je zodpovedných 17 génov, takzvaných génov nif. Všetky tieto gény sú navzájom prepojené a nachádzajú sa na chromozóme medzi génmi pre enzýmy biosyntézy histidínu a génmi, ktoré určujú absorpciu kyseliny šikimovej. V rýchlo rastúcej rizóbii existujú gény nif vo forme megaplazmidu obsahujúceho 200-300 tisíc párov báz.

Spomedzi génov fixujúcich dusík boli identifikované gény kontrolujúce štruktúru dusíkatej látky, proteínového faktora podieľajúceho sa na transporte elektrónov, a regulačné gény. Regulácia génov fixácie dusíka je pomerne zložitá, takže o genetickom inžinierstve upravenom prenose funkcie fixácie dusíka z baktérií priamo na vyššie rastliny sa v súčasnosti už nehovorí. Ako ukázali experimenty, ani v najjednoduchšom eukaryotickom organizme, kvasinkách, nebolo možné dosiahnuť expresiu génov nif, hoci pretrvávali 50 generácií.

Tieto experimenty ukázali, že diazotrofia (fixácia dusíka) je charakteristická výlučne pre prokaryotické organizmy a gény nif nedokázali prekonať bariéru oddeľujúcu prokaryoty a eukaryoty kvôli ich príliš zložitej štruktúre a regulácii génmi umiestnenými mimo oblasti nif. Možno bude prenos nif génov pomocou Ti plazmidov do chloroplastov úspešnejší, pretože mechanizmy génovej expresie v chloroplastoch a v prokaryotických bunkách sú podobné. V každom prípade musí byť dusíkatá látka chránená pred inhibičným pôsobením kyslíka. Navyše, fixácia atmosférického dusíka je energeticky veľmi náročný proces. Je nepravdepodobné, že rastlina pod vplyvom génov nif dokáže tak radikálne zmeniť svoj metabolizmus, aby vytvorila všetky tieto podmienky. Aj keď je možné, že v budúcnosti bude možné pomocou metód genetického inžinierstva vytvoriť ekonomicky fungujúci komplex dusíkatých látok.

Reálnejšie je použiť metódy genetického inžinierstva na riešenie nasledujúcich problémov: zvýšenie schopnosti rizóbií kolonizovať bôbovité rastliny, zvýšenie účinnosti fixácie a asimilácie dusíka ovplyvnením genetického mechanizmu, vytvorenie nových mikroorganizmov viažucich dusík zavedením génov nif do ich prenosom schopnosti symbiózy zo strukovín na ostatné .

Primárnou úlohou genetického inžinierstva na zvýšenie účinnosti biologickej fixácie dusíka je vytvorenie kmeňov rhizobií so zvýšenou fixáciou dusíka a schopnosťou kolonizácie. Kolonizácia bôbovitých rastlín rizóbiami prebieha veľmi pomaly, len z niekoľkých vznikajú uzliny. Je to preto, že miesto invázie rizóbií je len jedna malá oblasť medzi koreňovým rastovým bodom a koreňovým vláskom najbližšie k nemu, ktorý je v štádiu formovania. Všetky ostatné časti koreňa a vyvinuté koreňové vlásky rastliny sú necitlivé na kolonizáciu. V niektorých prípadoch vytvorené uzliny nie sú schopné fixovať dusík, čo závisí od mnohých rastlinných génov (bolo identifikovaných najmenej päť), najmä od nepriaznivej kombinácie dvoch recesívnych génov.

Pomocou tradičných metód genetiky a šľachtenia sa podarilo získať laboratórne kmene rizóbií s vyššou kolonizačnou schopnosťou. V teréne však zažívajú konkurenciu miestnych kmeňov. Zvýšenie ich konkurencieschopnosti sa zjavne dá dosiahnuť metódami genetického inžinierstva. Zvýšenie účinnosti procesu fixácie dusíka je možné pomocou techník genetického inžinierstva založených na zvyšovaní kópií génov, zvýšením transkripcie tých génov, ktorých produkty tvoria „úzke hrdlo“ v mechanizme kaskády fixácie dusíka, zavedením silnejších promótorov atď. na zvýšenie účinnosti nitrogenázového systému, ktorý priamo redukuje molekulárny dusík na amoniak.

Zlepšenie účinnosti fotosyntézy

Rastliny C4 sa vyznačujú vysokou rýchlosťou rastu a rýchlosťou fotosyntézy, prakticky nemajú viditeľnú fotorespiráciu. Väčšina poľnohospodárskych plodín patriacich do C3 rastlín má vysokú intenzitu fotorespirácie. Fotosyntéza a fotorespirácia sú úzko súvisiace procesy založené na bifunkčnej aktivite toho istého kľúčového enzýmu, ribulózabisfosfátkarboxylázy (RuBPC). RuBF karboxyláza môže viazať nielen CO2, ale aj O2, to znamená, že uskutočňuje karboxylačné a okysličovacie reakcie. Okysličením RuBF vzniká fosfoglykolát, ktorý slúži ako hlavný substrát pre fotorespiráciu, proces uvoľňovania CO2 vo svetle, v dôsledku čoho sa strácajú niektoré produkty fotosyntézy. Nízka fotorespirácia u rastlín C4 sa vysvetľuje nie absenciou enzýmov glykolátovej dráhy, ale obmedzením oxygenázovej reakcie, ako aj reasimiláciou fotorespiračného CO2.

Jednou z úloh genetického inžinierstva je študovať možnosť vytvorenia RuBPC s prevládajúcou karboxylázovou aktivitou.

Získavanie rastlín s novými vlastnosťami

V posledných rokoch vedci používajú nový prístup na produkciu transgénnych rastlín s "antisense RNA" (prevrátená alebo antisense RNA), ktorá vám umožňuje kontrolovať činnosť génu, ktorý je predmetom záujmu. V tomto prípade sa pri konštrukcii vektora kópia DNA (cDNA) vloženého génu prevráti o 180°. V dôsledku toho sa v transgénnej rastline vytvorí normálna molekula mRNA a invertovaná, ktorá s ňou vďaka komplementárnosti normálnej mRNA vytvorí komplex a kódovaný proteín sa nesyntetizuje.

Tento prístup sa použil na získanie transgénnych rastlín paradajok so zlepšenou kvalitou ovocia. Vektor obsahoval cDNA génu PG, ktorý riadi syntézu polygalakturonázy, enzýmu podieľajúceho sa na deštrukcii pektínu, hlavnej zložky medzibunkového priestoru rastlinných tkanív. Produkt génu PG sa syntetizuje počas obdobia dozrievania plodov paradajok a zvýšenie jeho množstva vedie k tomu, že paradajky zmäknú, čo výrazne znižuje ich trvanlivosť. Deaktivácia tohto génu v transgénoch umožnila získať rastliny rajčiakov s novými ovocnými vlastnosťami, ktoré nielenže vydržali oveľa dlhšie, ale samotné rastliny boli odolnejšie voči hubovým chorobám.

Rovnaký prístup možno použiť aj na reguláciu dozrievania paradajok a v tomto prípade sa ako cieľ používa gén EFE (enzým tvoriaci etylén), ktorého produktom je enzým podieľajúci sa na biosyntéze etylénu. Etylén je plynný hormón, ktorého jednou z funkcií je riadenie procesu dozrievania ovocia.

Stratégia antisense konštruktov sa široko používa na modifikáciu génovej expresie. Táto stratégia sa využíva nielen na získanie rastlín s novými kvalitami, ale aj na základný výskum v genetike rastlín. Treba spomenúť ešte ďalší smer rastlinného genetického inžinierstva, ktorý sa donedávna používal najmä v základnom výskume – na štúdium úlohy hormónov vo vývoji rastlín. Podstatou experimentov bolo získanie transgénnych rastlín s kombináciou určitých bakteriálnych hormonálnych génov, napríklad iba iaaM alebo ipt atď. Tieto experimenty významne prispeli k preukázaniu úlohy auxínov a cytokinínov v diferenciácii rastlín.

V posledných rokoch sa tento prístup využíva v praktickom chove. Ukázalo sa, že plody transgénnych rastlín s génom iaaM pod promótorom génu Def (gén, ktorý je exprimovaný iba v plodoch) sú partenokarpické, čiže vznikajú bez opelenia. Parthenokarpické plody sa vyznačujú buď úplnou absenciou semien, alebo ich veľmi malým počtom, čo umožňuje vyriešiť problém „extra semien“, napríklad v melóne, citrusových plodoch atď. Boli už získané transgénne rastliny tekvice, ktoré sa vo všeobecnosti nelíšia od kontrolných, ale prakticky neobsahujú semená.

Odzbrojený, bez onkogénov Ti-plazmid, vedci aktívne používajú na získanie mutácií. Táto metóda sa nazýva inzerčná mutagenéza T-DNA. T-DNA, integrujúca sa do rastlinného genómu, vypne gén, do ktorého je integrovaná a pri strate funkcie sa dajú ľahko selektovať mutanty (fenomén silencing – umlčanie génov). Táto metóda je pozoruhodná aj tým, že umožňuje okamžite odhaliť a klonovať zodpovedajúci gén. V súčasnosti sa týmto spôsobom získalo mnoho nových rastlinných mutácií a klonovali sa zodpovedajúce gény. MA Ramenskaya na základe mutagenézy T-DNA získala rastliny rajčiaka s nešpecifickou odolnosťou voči plesni. Nemenej zaujímavý je aj ďalší aspekt práce – získali sa transgénne rastliny so zmenenými dekoratívnymi vlastnosťami. Jedným z príkladov je výroba rastlín petúnie s viacfarebnými kvetmi. Ďalšie v poradí sú modré ruže s génom, ktorý riadi syntézu modrého pigmentu, klonovaného z delfínia. Problémy biologickej bezpečnosti transgénnych rastlín

Jednou z hlavných námietok voči používaniu „transgénnych“ potravín je prítomnosť génov rezistencie voči antibiotikám (najmä voči kanamycínu), ktoré boli obsiahnuté v pôvodnom konštrukte DNA ako selektívne, v mnohých z nich.

Predpokladá sa, že tieto gény rezistencie môžu byť pri trávení potravy prenesené do endogénnej mikroflóry, vrátane patogénov, v dôsledku čoho sa mikróby môžu stať rezistentnými voči tomuto antibiotiku. V skutočnosti je však pravdepodobnosť takejto udalosti zanedbateľná – početné experimenty a pozorovania v prírode týkajúce sa takéhoto horizontálneho prenosu génov zatiaľ priniesli len negatívne výsledky.

Netreba zabúdať, že gény rezistencie vložené do rastlín sú „vyladené“ na expresiu iba v eukaryotických, ale nie bakteriálnych bunkách. Malo by sa tiež vziať do úvahy, že tieto selektívne gény boli prevzaté z prirodzených populácií mikroorganizmov, kde sú teraz široko rozšírené v dôsledku aktívneho používania antibiotík v lekárskej praxi. Preto je pravdepodobnosť získania génu rezistencie na antibiotiká do ľudskej mikroflóry z prirodzeného rezervoáru neporovnateľne reálnejšia ako pri použití transgénnych rastlín. Vzhľadom na verejnú mienku sa však vyvíjajú prístupy na vylúčenie prítomnosti „podozrivých“ génov v komercializovaných transgénnych formách.

Vo väčšine prípadov sú markerové gény antibiotickej rezistencie teraz nahradené génmi rezistencie na herbicídy. Pravda, použitie „herbicídnych“ génov tiež naráža na námietky, ale už ekológov. Bolo navrhnutých niekoľko metód na selektívnu elimináciu markerového génu po získaní požadovanej transgénnej rastliny, keď už nie je v skutočnosti potrebná.

Ako veľmi perspektívne sa javí nahradenie selektívnych génov reportérovými pri selekcii transgénnych foriem rastlín, prípadne využitie alternatívnych selektívnych génov, ako sú gény pre syntézu fytohormónov či hydrolýzu špecifických foriem polysacharidov pri pestovaní rastlín v kultivačnom médiu. Aj toto virtuálne nebezpečenstvo spojené s génmi rezistencie na antibiotiká teda čoskoro prestane existovať.

S ohľadom na možnú toxicitu či alergénnosť transgénnych rastlín tu platia rovnako prísne normy ako pre tradične získavané nové odrody kultúrnych rastlín alebo nové druhy potravín. V týchto parametroch by sa nemali očakávať žiadne zvláštne rozdiely medzi transgénnymi rastlinami a bežnými rastlinami (okrem lepších pri blokovaní syntézy toxínov alebo alergénov) a spravidla sa v praxi nepozorujú.

Problém možného poškodenia životného prostredia má viacero aspektov. Po prvé, existuje obava, že plodiny tolerantné voči herbicídom by mohli preniesť tieto gény prostredníctvom medzidruhového opelenia na úzko súvisiace buriny, z ktorých by sa mohli vyvinúť nezničiteľné superburiny. Hoci je pravdepodobnosť takéhoto nežiaduceho vývoja udalostí pre väčšinu plodín veľmi malá, genetickí inžinieri a poľnohospodárski vedci aktívne vyvíjajú prístupy na odstránenie takéhoto nebezpečenstva. Tu je však potrebné poznamenať, že táto problematika tiež nie je novinkou, keďže množstvo odrôd odolných voči herbicídom získaných konvenčným šľachtením sa už dlho používa v poľnohospodárskej praxi. Plošné používanie takýchto odolných odrôd zároveň zatiaľ nespôsobilo žiadnu ekologickú katastrofu.

Napriek tomu sa aj v tomto prípade, aby odvrátili akékoľvek námietky zo strany transgénnych rastlín, snažia napríklad vniesť do rastlín nie jeden, ale hneď niekoľko génov odolnosti voči rôznym herbicídom. Prenos niekoľkých génov na burinu je oveľa menej pravdepodobný ako jeden gén. Navyše multiherbicídna rezistencia umožní striedanie rôznych herbicídov pri ošetrovaní plodín, čo neumožní šírenie žiadneho konkrétneho génu rezistencie v burinách.

Tiež sa navrhuje zaviesť gény rezistencie nie do jadrového, ale do chloroplastového genómu. To môže zabrániť nežiaducemu génovému driftu peľom, pretože chloroplasty sa dedia iba cez materskú líniu.

Ďalší geneticky upravený spôsob kontroly buriny bez použitia génov rezistencie na herbicídy vo všeobecnosti je biotransgénny. Hovoríme o využívaní malých zvierat, ako sú králiky, na požieranie buriny na poliach. Zároveň, aby boli pestované rastliny chránené pred zožratím, môže sa do nich zaviesť nejaký gén, ktorý ich robí pre daného živočícha neatraktívne (vôňa, chuť). Takýto biotransgénny prístup by okamžite odstránil väčšinu súčasných námietok voči transgénnym plodinám.

Súvisiace environmentálne námietky sa týkajú transgénnych rastlín so zabudovanými "insekticídnymi" génmi, o ktorých sa predpokladá, že sú schopné vyvolať vznik masovej rezistencie u hmyzích škodcov. Navrhuje tiež účinné spôsoby na zníženie tohto nebezpečenstva, napríklad použitie génov pre niekoľko rôznych toxínov a/alebo indukovateľných promótorov, ktoré sa rýchlo aktivujú, keď hmyz napadne rastlinu. Tento problém vo všeobecnosti nie je nový, pretože mnohé z insekticídov, ktoré sa v súčasnosti používajú na "génovej úrovni", sa už dlho používajú vo forme čistej látky na postrek plodín.

Ďalším nežiaducim dôsledkom používania transgénnych rastlín s insekticídnymi génmi je, že peľ týchto rastlín môže byť toxický aj pre užitočný hmyz, ktorý sa peľom živí. Niektoré experimentálne údaje tomu nasvedčujú. že takéto nebezpečenstvo skutočne existuje, hoci o jeho možnom rozsahu je stále ťažké hovoriť. Tu však už boli navrhnuté a otestované adekvátne riešenia genetického inžinierstva, napríklad využitie transgenézy prostredníctvom chloroplastovej DNA alebo promótorov, ktoré nefungujú v peli.

Nádeje, ktoré sú vkladané na geneticky modifikované (GM) rastliny možno rozdeliť do dvoch hlavných oblastí:

1.Zlepšovanie kvalitatívnych charakteristík rastlinnej výroby.

2. Zvýšenie produktivity a stability rastlinnej výroby zvýšením odolnosti rastlín voči nepriaznivým faktorom.

Vytváranie geneticky modifikovaných rastlín sa najčastejšie vykonáva na riešenie nasledujúcich špecifických problémov:

1) S cieľom zvýšiť produktivitu zvýšením:

a) odolnosť voči patogénom;

b) odolnosť voči herbicídom;

c) odolnosť voči nepriaznivým teplotám, pôde nízkej kvality;

d) zlepšenie vlastností produktivity (chuťové a nutričné vlastnosti, optimálny metabolizmus).

2) Na farmakologické účely:

a) získavanie výrobcov terapeutických činidiel;

b) výrobcovia antigénov, zabezpečujúci potravinovú „pasívnu“ imunizáciu.

Hlavné úlohy technológie DNA pri vytváraní GM rastlín v moderných podmienkach rozvoja poľnohospodárstva a spoločnosti sú dosť rôznorodé a sú nasledovné:

1. Získanie hybridov (kompatibilita, samčia sterilita).

2. Optimalizácia rastu a vývoja rastlín (zmeny habitusu rastlín – napr. výška, tvar listov a koreňového systému a pod.; zmeny kvitnutia – napr. štruktúra a farba kvetov, doba kvitnutia).

3. Optimalizácia výživy rastlín (fixácia vzdušného dusíka nestrukovinovými rastlinami; zlepšenie vstrebávania minerálnych živín; zvýšená účinnosť fotosyntézy).

4. Zlepšenie kvality výrobkov (zmena zloženia a/alebo množstva tukov; zmena chuti a vône potravinárskych výrobkov; získanie nových druhov liečivých surovín; zmena vlastností vlákien pre textilné suroviny; zmena kvality a načasovania zrenia alebo skladovanie ovocia).

5. Zvyšovanie odolnosti voči abiotickým stresovým faktorom (tolerancia sucha a slanosti. Tepelná odolnosť; odolnosť voči povodniam; adaptácia na chlad; odolnosť voči herbicídom; odolnosť voči kyslosti pôdy a hliníku; odolnosť voči ťažkým kovom).

6. Zvyšovanie odolnosti voči biotickým stresovým faktorom (odolnosť voči škodcom4 odolnosť voči bakteriálnym, vírusovým a hubovým chorobám).

Spomedzi génov odolnosti voči herbicídom už boli klonované gény rezistencie voči herbicídom, ako je glyfosát (Roundup). Fosfinotricín (Bialafos), glyfosinát amónny (Basta), sulfonylmočovina a imidozolinové lieky. S použitím týchto génov sa už získali transgénne sójové bôby, kukurica, bavlna atď. V Rusku sa testujú aj transgénne plodiny odolné voči herbicídom. Centrum bioinžinierstva vyvinulo odrodu zemiakov odolnú voči Basta, ktorá v súčasnosti prebieha v teréne.

n Celková plocha pestovania geneticky modifikovaných (GM) transgénnych rastlín v roku 2004 vo svete predstavovala 81 miliónov hektárov

n V zásade ide o GM modifikované z hľadiska odolnosti voči patogénom a herbicídom

Tieto štúdie prispievajú k vývoju nových prístupov v poľnohospodárstve - k diagnostike chorôb, identifikácii genetických vlastností plemien a odrôd pre šľachtenie zvierat a rastlín s novými zlepšenými vlastnosťami na základe riadených zmien v genómoch. V moderných technológiách DNA u zvierat a rastlín možno rozlíšiť tri hlavné oblasti:

1) DNA - technológie na riadenie toku genetického materiálu (výber pomocou molekulárno-genetických markerov - MAS, na tento účel - mapovanie, označovanie hlavných génov kvantitatívnych znakov - QTL); zachovanie biodiverzity pomocou molekulárno-genetických markerov; vývoj geneticky podložených šľachtiteľských programov a výber rodičovských foriem organizmov s prihliadnutím na údaje ekologickej genetiky.

2) DNA technológie na vytváranie nových foriem organizmov s cieľom získať „bioreaktory“ (producenti terapeuticky dôležitých proteínov pre ľudí), štúdium genetických mechanizmov vývoja a prevencie rôznych chorôb, ako aj základné štúdie štrukturálnej a funkčnej organizácie genetický materiál, medzigénové interakcie.

3) DNA technológia na cielenú produkciu a reprodukciu požadovaných genotypov - využitie kmeňových embryonálnych bunkových línií, cielená modifikácia určitých génov, získanie jednovaječných dvojčiat a pod.

DNA ekológia. Množstvo environmentálnych a agroekologických problémov, pri riešení ktorých sa veľké nádeje vkladajú do technológie DNA, má komplexný charakter. Medzi ne patrí problém zlepšovania úrodnosti pôdy. Použitie hnojív na tieto účely, najmä dusíkatých, neprináša požadovaný účinok z dvoch dôvodov. Po prvé, chemická syntéza dusíkatých hnojív sa uskutočňuje pomocou energeticky náročného a drahého procesu. Po druhé, na vytvorenie potrebnej koncentrácie hnojív v pôde sa aplikujú v nadbytku a vo významnom množstve sa vyplavujú, čo vedie k znečisteniu vodných plôch a nežiaducim zmenám životného prostredia. V tejto súvislosti budú musieť technológie DNA vyvinúť spôsoby využitia biologického systému fixácie dusíka na poskytovanie amónnych solí plodinám. Existuje niekoľko možností riešenia tohto problému: použitie voľne žijúcich baktérií viažucich dusík alebo izolovanej modifikovanej dusíkatej látky (enzým, ktorý vedie biologickú fixáciu dusíka) pri priemyselnej výrobe amoniaku; zvýšenie účinnosti prirodzených symbiontných baktérií viažucich dusík a rozvoj nových symbiotických asociácií; zavedenie génov fixácie dusíka (nif-génov) do kultúrnych rastlín .. a iné.

1. Sľubný vývoj v oblasti genetického inžinierstva.

2. Čo sú molekuly rekombinantnej DNA?

3. Čo je to genetická transformácia v rastline?

4. Uveďte hlavné metódy genetického inžinierstva rastlín.

5. Popíšte spôsoby zvýšenia biologickej fixácie atmosférického dusíka.

Literatúra:

1. Alberts B., Bray D., Lewis J. a kol., Molekulárna biológia bunky. T. 1 - 3. M.: Mir, 1994.

2. Analýza genómu. Methods / Ed. K. Davis. M.: Mir, 1990. 246 s.

3. Atanasov A. Biotechnológia v rastlinnej výrobe. Novosibirsk: ICGSO RAN, 1993. - 241 s.

4. Baranovov V.S. Génová terapia – medicína XXI storočia // Soros Educational Journal. č. 3. 1999. S. 3 - 68.

5. Beker M. E., Liepinsh G.K., Raipulis E.P. Biotechnológia. M.: Agropromizdat, 1990. 334 s.

6. Borisyuk N.V. Molekulárno - genetická konštitúcia somatických hybridov // Biotechnológia. Výsledky vedy a techniky VINITI AS ZSSR. M., 1988. T. 9. S. 73-113.

7. Valikhanov G. Zh. Biotechnológia rastlín. Almaty: Konzhyk, 1996. 272 s.

8. Gleba Yu. Yu. Rastlinná biotechnológia // Soros Educational Journal. č. 6. 1998. S. 3 - 8.

9. Glebov OK Genetická transformácia somatických buniek // Metódy kultivácie buniek. L.: Nauka, 1988.

10. Goldman I. L., Razin S. V., Ernst L. K., Kadulin S. G., Grashchuk M. A. Molekulárne biologické aspekty problému pozične nezávislej expresie cudzích génov v bunkách transgénnych zvierat // Biotechnológia. 1994. Číslo 2.

11. Dyban A. P., Gorodetsky S. I. Zavedenie cudzích génov do genómu cicavcov: spôsoby a vyhliadky // Molekulárne a bunkové aspekty biotechnológie. L.: Nauka, 1986. S. 82 - 97.

12. Egorov N. S., Samuilov V. D. Moderné metódy vytvárania priemyselných kmeňov mikroorganizmov // Biotechnológia. Kniha. 2. M.: Vyššia škola, 1988. 208 s.

13. Zvereva S. D., Romanov G. A. Reportérové gény pre genetické inžinierstvo rastlín: charakteristiky a testovacie metódy // Fyziológia rastlín. 2000. V. 47, č. 3. S. 479-488.

14. Leshchinskaya I. B. Genetické inžinierstvo // Soros Educational Journal. 1996. č. s. 33 - 39.

15. Lee A., Tinland B. Integrácia t-DNA do rastlinného genómu: prototyp a realita // Fyziológia rastlín. 2000, zväzok 47, č. 3, s. 354-359

16. L. A. Lutova, N. A. Provorov, O. N. Tikhodeev a kol., Genetika vývoja rastlín. Petrohrad: Nauka, 200. 539 s.

17. Lewin B. Genes. M.: Mir, 1987. 544 s.

18. Piruzyan E. S., Andrianov V. M. Plazmidy agrobaktérií a genetické inžinierstvo rastlín Moskva: Nauka, 1985. 280 s.

19. Piruzyan E. S. Genetické inžinierstvo rastlín M.: Znanie, 1988. 64 s.

20. Piruzyan E. S. Základy genetického inžinierstva rastlín M.: Nauka, 1988. 304 s.

21. Piruzyan E.S. Problémy expresie cudzích génov v rastlinách // Itogi nauki i tekhniki VINITI. Ser. Biotechnológia. 1990. T. 23. 176 s.

22. Popov L. S., Yazykov A. A. Transgénne zvieratá ako modely na štúdium reprodukcie embryonálneho vývoja a ľudských chorôb // Úspechy modernej biológie. 1999. T 119, č. 1. S. 30-41.