22. Methoden zur Isolierung reiner Aerobierkulturen.
Der Prozess der Isolierung einer Reinkultur kann in mehrere Phasen unterteilt werden.
Erste Stufe. Aus dem Testmaterial wird ein Ausstrich angefertigt, dieser nach Gram oder einer anderen Methode gefärbt und mikroskopisch kopiert. Zur Beimpfung wird das Testmaterial ggf. im Reagenzglas mit einer sterilen isotonischen Natriumchloridlösung verdünnt. Ein Tropfen der vorbereiteten Verdünnung wird in einer Öse auf die Oberfläche des Nähragars in einer Petrischale aufgetragen und mit einem Spatel vorsichtig in das Medium eingerieben, wobei das Material gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt wird. Nach der Aussaat wird der Becher auf den Kopf gestellt, signiert und für 18–24 Stunden in einen Thermostat bei einer Temperatur von 37 °C gestellt.
Zweite Phase. Sie durchsuchen die Schalen und untersuchen isolierte Kolonien, wobei sie auf deren Form, Größe, Konsistenz und andere Anzeichen achten. Um die Morphologie von Zellen und ihre färbenden Eigenschaften zu bestimmen, wird aus einem Teil der untersuchten Kolonie ein Abstrich hergestellt, nach Gram gefärbt und mikroskopiert. Um eine Reinkultur zu isolieren und anzureichern, werden eine isolierte Kolonie oder mehrere verschiedene isolierte Kolonien in separate Röhrchen mit Schrägagar oder einem anderen Nährmedium inokuliert. Dazu wird ein Teil der Kolonie mit einer Schlaufe entfernt, ohne die benachbarten Kolonien zu berühren.
Die dritte Stufe: Beachten Sie die Art des Wachstums der ausgewählten Reinkultur. Eine optisch saubere Kultur zeichnet sich durch ein gleichmäßiges Wachstum aus. Die mikroskopische Untersuchung eines gefärbten Abstrichs, der aus einer solchen Kultur hergestellt wurde, zeigt morphologisch und farblich homogene Zellen. Bei einem ausgeprägten Polymorphismus, der einigen Bakterienarten innewohnt, werden in Abstrichen aus einer Reinkultur jedoch neben typischen auch andere Zellformen gefunden.
23. Methoden zur Isolierung reiner Anaerobierkulturen.
Nährmedien für Anaerobier müssen die folgenden Grundanforderungen erfüllen: 1) den Nährstoffbedarf decken; 2) das schnelle Wachstum von Mikroorganismen gewährleisten; 3) ausreichend reduziert werden
Kulturen zur Isolierung anaerober Mikroflora, sowohl sporenbildender (Clostridien) als auch nicht sporenbildender (Veillonella, Bakteroide, Peptokokken), werden unter streng anaeroben Bedingungen durchgeführt. Primäre Inokulationen erfolgen auf Anreicherungsmedien (Thioglykol, Kitta-Tarozzi) und werden dann auf festen Medien subkultiviert: Zuckerblutagar in Petrischalen, in einer hohen Säule Zuckernähragar oder anderen Medien, um isolierte Kolonien zu erhalten. Nach der Inkubation der Inokulationen unter anaeroben Bedingungen werden Ausstriche aus den resultierenden Bakterienkolonien hergestellt, mikroskopisch gefärbt und dann auf Kitt-Tarozzi-Medium und Agar-Medium subkultiviert, um eine Reinkultur zu isolieren.
Bei der Isolierung sporenbildender anaerober Bakterien (Clostridien) werden die Ausgangskulturen 20 Minuten lang in einem Wasserbad auf eine Temperatur von 80 °C erhitzt, um vegetative Zellen fremder Mikroflora, die möglicherweise im Testmaterial vorhanden sind, zu zerstören.
24. Identifizierung von Mikroorganismen morphologisch, kulturell, serologisch, biologisch, genetisch.
Identifizierung ist die Bestimmung einer systematischen Position, Auswahl aus einer beliebigen Quelle bis hin zur Ebene einer Art oder Variante.
25. Biochemische Identifizierungsmethode: Bestimmung der proteolytischen. saccharolytische, lipolytische Eigenschaften, Nachweis von Hämolysinen und Oxidoreduktasen. Einsatz automatischer mikrobiologischer Analysegeräte .
Bei dieser Methode wird der enzymatische Abbau verschiedener Substrate (Kohlenhydrate, Aminosäuren und Proteine, Harnstoff, Wasserstoffperoxid usw.) unter Bildung von Zwischen- und Endprodukten untersucht
Produkte.
Kohlenhydrate- Enzyme, die Kohlenhydrate abbauen. Durch die Bestimmung von Kohlenhydraten, den sogenannten. saccharolytische Eigenschaften von Mikroben. Hierzu kommen folgende Medien zum Einsatz:
a) Zischende Medien (flüssig und halbflüssig mit Indikatoren). Als letzteres werden Andredes Reagenz, Bromthymolblau oder BP verwendet. Die enzymatische Aktivität von Bakterien wird anhand der Farbänderung des Mediums und der Gasbildung beurteilt;
b) differenzialdiagnostische Medien mit Laktose (Endo, Levina, Ploskireva usw.);
c) Polykohlenhydratmedien (wie Olkenitsky, Kligler usw.).
Proteasen-Enzyme, die Proteine abbauen
a) Die untersuchte Kultur kann Substratproteine unter Bildung von Pepton, Albumose und Aminosäuren spalten. Dieser Prozess ist auf Enzyme – Proteinasen und Peptidasen – zurückzuführen. Um diese Enzyme zu identifizieren, wird die untersuchte Kultur auf eine Reihe von Medien geimpft: geronnene Molke, Gelatinesäule (Verflüssigung in positiven Fällen), Milchagar in einer Petrischale (in positiven Fällen treten Trübungszonen um die Kolonien herum auf);
b) Die Spaltung von Aminosäuren durch Mikroben kann durch Decarboxylierung oder Desaminierung erfolgen. Im ersten Fall werden aus der einen oder anderen Aminosäure Amine gebildet, die entweder durch Elektrophorese nachgewiesen werden. oder durch Alkalisierung der Umgebung. Das Vorhandensein von Desaminasen in einer Mikrobe wird anhand der Bildung von Ammoniak im Medium als Ergebnis des Prozesses der Aminosäuredesaminierung beurteilt;
c) Die Spaltung der Tryptophan-Aminosäure durch die Wirkung des Enzyms Tryptophanase geht mit der Bildung von Indol einher. Letzteres wird mit Hilfe eines mit Oxalsäure befeuchteten und unter einem Korken über einem Nährmedium fixierten Stück Papier nachgewiesen. Im positiven Fall verfärbt sich das Papier rot;
d) Zur Identifizierung von Enzymen zur Spaltung schwefelhaltiger Aminosäuren (Cystin, Cystein) werden Tests auf H2S durchgeführt, als Produkt der Spaltung dieser Aminosäuren durch Desulfurasen. Das Vorhandensein von H2S wurde auch in Olkenitskys Umgebung festgestellt;
e) Zum Nachweis von Urease, einem Enzym, das Harnstoff abbaut, werden Harnstoff und ein Indikator einem Nährmedium mit neutralem pH-Wert zugesetzt. In positiven Fällen ändert sich die Farbe des Mediums aufgrund einer pH-Wert-Verschiebung zur alkalischen Seite aufgrund der Bildung von Ammoniak. Lipasen- Enzyme zum Abbau von Lipiden und Lipoiden. Am häufigsten wird Lecithinase durch Inokulation auf Dotteragar bestimmt. Lecithinase spaltet Lecithin in Phosphocholin und Diglycerid auf. In diesen Fällen treten mit dem Wachstum der Kolonien um sie herum opaleszierende Zonen auf, die die Lecithinase-Aktivität widerspiegeln.
Enzyme-Toxine : Hämolysine – Enzyme zur Spaltung der Phospholipidmembran von Erythrozyten. Der Nachweis erfolgt durch Kultur auf Blutagar (5-10 %). Es gibt b-Hämolyse oder vollständige Hämolyse, wenn sich um die Kolonien erleuchtete Zonen bilden, a-Hämolyse, unvollständige Hämolyse, wenn um die Kolonien grüne Zonen vorhanden sind. Das Fehlen einer Hämolyse wird als D-Hämolyse bezeichnet.
Zytotoxine- Enzyme, die eine toxische Wirkung auf Zielzellen haben. Beispielsweise wird die Zytotoxizität des Toxins anaerober Mikroorganismen in Zellkulturen bestimmt. Zu diesem Zweck wird 1 g des Materials (Kot oder anderes) in Phosphatpuffer 1:10 w/v verdünnt und 30 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird auf einem 2O-nm-Filter filtriert, in eine Monoschicht einer McCoy-Zellkultur gegeben und 24–48 Stunden bei 37 °C inkubiert, bis eine toxische Wirkung erreicht wird.
Immunchemische Bestimmung der Produktion von Toxinen: Zur Bestimmung vieler Exotoxine – Diphtherie, Cholera, Staphylokokken usw. – wird in der Regel ein Enzymimmunoassay-Verfahren verwendet. Hierzu werden Testsysteme verwendet, die auf monoklonalen Antikörpern gegen ein bestimmtes Exotoxin basieren.
Pasmokoagulase Ein Enzym, das das Blutplasma von Tieren koaguliert. Bestimmt in einer Reagenzglasreaktion. In 1 ml Kaninchen- oder Human-Citratplasma (ganz oder 2- und 4-fach mit Kochsalzlösung verdünnt) wird eine Öse einer täglichen Agarkultur der Mikrobe gerührt. Die Mischung wird in einem Thermostat bei 37°C inkubiert. In positiven Fällen gerinnt das Plasma nach 2-4 Stunden (es entsteht ein Gerinnsel). Lecithinase – siehe oben.
Oxidoreduktasen:
1. Definition Oxidase. Auf Filterpapier, das mit einer 1 %igen Lösung von Tetramethylparaphenylendiamin befeuchtet ist, werden Streifen der Testkultur in einer Öse aufgetragen. Im positiven Fall erscheint eine violette Färbung der Banden (innerhalb von 1 Minute).
2. Definition von Katalase. Ein Tropfen 3 %ige Wasserstoffperoxidlösung wird auf einen Glasobjektträger aufgetragen und dort eine Öse der Testkultur eingeführt. In Gegenwart von Katalase bilden sich Sauerstoffblasen.
3. Definition von Dehydrasen. Das Vorhandensein von Dehydrasen wird anhand der Reduktionsfähigkeit der Mikrobe beurteilt, d. h. Fähigkeit, einige organische Farbstoffe wiederherzustellen (z. B. 1 %ige wässrige Lösung von Methylenblau). Ein Farbstoff (Wasserstoffakzeptor) wird zu einer Säule aus Zuckeragar (Wasserstoffdonor) gegeben und die mikrobielle Kultur wird mit einem Pik beimpft. In positiven Fällen führt die Mikrobe, die auf einem solchen Medium wächst, zu einer Verfärbung.
4. Bestimmung des Spektrums kurzkettiger Fettsäuren (SCFA), Anaerobe Mikroorganismen produzieren Zwischenprodukte, darunter kurzkettige Fettsäuren und Alkohole, deren Spektrum (Profil) für verschiedene Arten von Mikroorganismen unterschiedlich ist und die Identifizierung von Mikroorganismen bis auf Gattungsebene ermöglicht. Am häufigsten untersucht werden Essigsäure, Propionsäure, Butylsäure, Isobutylsäure, Valeriansäure, Isovaleriansäure, Capronsäure und Isocapronsäure. Zur Bestimmung von SCFA wird die Methode der Gas-Flüssigkeits-Chromatographie verwendet. Es werden Mikroorganismen wie Actinomyceten, Prolionibakterien, Eubakterien, Bifidobakterien und Clostridien identifiziert.
In den letzten Jahren wurden in bakteriologischen Laboren kommerzielle Testsysteme zur schnellen biochemischen Identifizierung (Bestimmung der biochemischen Aktivität verschiedener Gruppen von Mikroorganismen) eingesetzt: beispielsweise 20 Tests für Enterobakterien und 30 Tests für Anaerobier. Das Identifizierungsschema umfasst die folgenden Schritte:
Kolonien ---- Vorbereitung ---- Anwendung ----- Inkubation ---- Abrechnung(+ -) ---- Inter-
Suspensionen Suspensionen 4 Stunden 37°C Anwendung am Mittwoch
Als Material zur Identifizierung wird eine gut isolierte Kolonie auf einer Schale oder eine Reinkultur im Reagenzglas verwendet, aus der eine Suspension in einer Konzentration des optischen Dichtestandards N4 hergestellt und anschließend 55 µl der Suspension zugegeben werden die Vertiefungen mit den Medien dieses Testsystems. Die Platte mit Streifen wird 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Abrechnung kann automatisch (mit dem „ATV“-Gerät) oder visuell erfolgen. Das Ergebnis der biochemischen Reaktion wird in Form von „+“ oder „-“ ausgewertet und in die Referenztabelle eingetragen, in der ein positives Ergebnis entspricht ein numerischer Ausdruck, der ein bestimmtes numerisches Profil ergibt, das einem speziell entwickelten analytischen Profilindex entspricht, der es Ihnen ermöglicht, das eine oder andere schnell zu identifizieren
Mikroorganismus.
Pasteur-Methode (Methode zur Begrenzung der Verdünnungen). Es besteht darin, dass aus dem Untersuchungsmaterial mehrere aufeinanderfolgende Verdünnungen in einem flüssigen Nährmedium hergestellt werden. Dazu wird ein Tropfen Inokulum in ein Reagenzglas mit einem sterilen flüssigen Medium gegeben, von dem ein Tropfen in das nächste Reagenzglas überführt und so bis zu 8-10 Reagenzgläser beimpft werden. Mit jeder Verdünnung nimmt die Anzahl der in das Medium gelangenden Mikrobenzellen ab, und es ist möglich, eine solche Verdünnung zu erhalten, bei der sich im gesamten Reagenzglas mit dem Medium nur eine Mikrobenzelle befindet, aus der eine Reinkultur des Mikroorganismus entsteht wird sich entwickeln. Da Mikroben in flüssigen Medien diffus wachsen, d.h. Da sie sich leicht in der Umwelt verteilen, ist es schwierig, eine mikrobielle Zelle von einer anderen zu isolieren. Daher liefert die Pasteur-Methode nicht immer eine Reinkultur. Daher wird diese Methode derzeit hauptsächlich dazu verwendet, die Konzentration von Mikroorganismen im Material vorab zu reduzieren, bevor es in einem dichten Medium beimpft wird, um isolierte Kolonien zu erhalten.
Methoden zur mechanischen Trennung von Mikroorganismen unter Verwendung dichter Nährmedien. Zu diesen Methoden gehören die Koch-Methode und die Drygalsky-Methode.
Koch-Methode (Tiefsaatmethode). Das Testmaterial wird mit einer bakteriologischen Öse oder einer Pasteurpipette in ein Reagenzglas mit geschmolzenem, dichtem Nährmedium eingebracht. Rühren Sie den Inhalt des Reagenzglases gleichmäßig um, indem Sie es zwischen den Handflächen drehen. Ein Tropfen des verdünnten Materials wird in das zweite Reagenzglas überführt, vom zweiten in das dritte und so weiter. Der Inhalt jedes Röhrchens, beginnend mit dem ersten, wird in sterile Petrischalen gegossen. Nach dem Erstarren des Mediums in den Bechern werden diese zur Kultivierung in einen Thermostat gestellt.
Um anaerobe Mikroorganismen nach der Koch-Methode zu isolieren, ist es notwendig, den Sauerstoffzugang zur Kultur zu begrenzen. Zu diesem Zweck wird die Oberfläche der Tiefsaat in einer Petrischale mit einer sterilen Mischung aus Paraffin und Vaseline (1:1) gefüllt. Sie können das Inokulum auch gründlich mit dem Agarmedium vermischt direkt im Reagenzglas belassen. Gleichzeitig wird der Wattepfropfen durch einen Gummistopfen ersetzt oder die Agaroberfläche mit einer Mischung aus Paraffin und Vaselineöl übergossen. Um die gewachsenen Kolonien anaerober Mikroorganismen zu extrahieren, werden die Reagenzgläser durch schnelles Rotieren über einer Brennerflamme leicht erhitzt. Der an die Wände angrenzende Agar schmilzt und die Säule lässt sich leicht in die vorbereitete Petrischale gleiten. Anschließend wird die Agarsäule mit einem sterilen Skalpell angeschnitten, die Kolonien mit einer sterilen Öse oder einem sterilen Kapillarschnitt entnommen und in ein flüssiges Medium überführt.
Drygalski-Methode basiert auf der mechanischen Trennung mikrobieller Zellen auf der Oberfläche eines dichten Nährmediums in Petrischalen. Jede mikrobielle Zelle, die sich an einem bestimmten Ort festsetzt, beginnt sich zu vermehren und eine Kolonie zu bilden.
Für die Aussaat nach der Drygalsky-Methode werden mehrere Petrischalen verwendet, die mit einem dichten Nährmedium gefüllt sind. Ein Tropfen des Testmaterials wird auf die Oberfläche des Mediums gegeben. Anschließend wird dieser Tropfen mit einem sterilen Spatel über den gesamten Nährboden verteilt (Aussaat mit Rasen).
Die Aussaat kann auch durch Ausstreichen mit einer bakteriologischen Öse erfolgen. Mit demselben Spatel oder derselben Schlaufe erfolgt die Aussaat im zweiten, dritten usw. Tassen. In der Regel zeigt sich in der ersten Schale nach der Kultivierung der Inokulation ein mikrobielles Wachstum in Form einer kontinuierlichen Plaque, in den folgenden Schalen nimmt der mikrobielle Gehalt ab und es bilden sich isolierte Kolonien, aus denen durch Screening leicht eine Reinkultur isoliert werden kann.
Auf diese Weise wird in den ersten Sektoren ein kontinuierliches Wachstum erreicht, und in den nachfolgenden Abschnitten wachsen isolierte Kolonien, die die Nachkommen einer Zelle sind.
Um Medien und Utensilien zu sparen, können Sie eine Schale verwenden, diese in Sektoren unterteilen und diese nacheinander mit einem Hub beimpfen (Depletion-Stroke-Methode). Dazu wird das Material mit einer Schlaufe aufgenommen und damit zunächst eine Reihe paralleler Striche über die Oberfläche des ersten Sektors gezogen, anschließend werden alle anderen Sektoren mit den auf der Schlaufe verbleibenden Zellen besät. Mit jedem weiteren Schlag nimmt die Anzahl der ausgesäten Zellen ab.
Verfahren zur Isolierung reiner Kulturen mittels Chemikalien Wird zur Isolierung von Kulturen von Mikroorganismen verwendet, die gegen bestimmte Chemikalien resistent sind. Mit dieser Methode kann beispielsweise eine Reinkultur des Mycobacterium tuberculosis isoliert werden, die gegen Säuren, Laugen und Alkohol resistent ist. In diesem Fall wird das Testmaterial vor der Aussaat mit einer 15 %igen Säurelösung oder Antiformin gegossen und 3-4 Stunden in einem Thermostat aufbewahrt. Nach Einwirkung von Säure oder Lauge bleiben die Zellen des Tuberkelbazillus am Leben und alle anderen im Testmaterial enthaltenen Mikroorganismen sterben ab. Nach Säure- oder Alkalineutralisation wird das behandelte Material auf ein festes Medium ausgesät und isolierte Kolonien des Tuberkuloseerregers gewonnen.
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Kulturelle Eigenschaften von Bakterien
Zu den kulturellen (oder makromorphologischen) Eigenschaften zählen charakteristische Merkmale des Wachstums von Mikroorganismen auf festen und flüssigen Nährmedien. Auf der Oberfläche dichter Nährböden können Mikroorganismen je nach Aussaat in Form von Kolonien, einem Strich oder einem durchgehenden Rasen wachsen.Eine Kolonie ist eine isolierte Ansammlung von Zellen derselben Art, die aus einer Zelle (Zellklon) gewachsen sind. Je nachdem, wo der Mikroorganismus wächst (auf der Oberfläche eines dichten Nährmediums oder in seiner Dicke), werden Oberflächen-, Tiefen- und Bodenkolonien unterschieden.
Die auf der Oberfläche des Mediums gewachsenen Kolonien sind vielfältig: Sie sind artspezifisch und ihre Untersuchung dient der Bestimmung der Artzugehörigkeit der untersuchten Kultur.
Bei der Beschreibung von Kolonien werden folgende Merkmale berücksichtigt:
1) die Form der Kolonie – rund, amöboid, rhizoidal, unregelmäßig usw.;
2) die Größe (Durchmesser) der Kolonie – sehr klein (punktgenau) (0,1–0,5 mm), klein (0,5–3 mm), mittelgroß (3–5 mm) und groß (mehr als 5 mm Durchmesser). ;
3) die Oberfläche der Kolonie ist glatt, rau, gefaltet, faltig, mit konzentrischen Kreisen oder radial gestreift;
4) das Profil der Kolonie – flach, konvex, kegelförmig, kraterförmig usw.;
5) Transparenz – matt, matt, glänzend, transparent, mehlig;
6) die Farbe der Kolonie (Pigment) – farblos oder pigmentiert (weiß, gelb, golden, rot, schwarz), besonders hervorzuheben ist die Freisetzung des Pigments in das Medium mit seiner Färbung;
7) der Rand der Kolonie – gleichmäßig, gewellt, gezackt, gesäumt usw.;
8) die Struktur der Kolonie – homogen, fein- oder grobkörnig, gestreift; Rand und Struktur der Kolonie werden mit einer Lupe oder bei geringer Vergrößerung des Mikroskops bestimmt, indem die Petrischale mit der Aussaat mit geschlossenem Deckel auf den Mikroskoptisch gestellt wird;
9) die Konsistenz der Kolonie; bestimmt durch Berühren der Oberfläche mit einer Öse: Die Kolonie kann dicht, weich, in Agar hineinwachsend, schleimig (greift nach der Öse), zerbrechlich (sie bricht leicht, wenn sie mit der Öse in Kontakt kommt).
Tiefe Kolonien sehen meist aus wie mehr oder weniger abgeflachte Linsen (ovale Form mit spitzen Enden), manchmal wie Wattebäusche mit fadenförmigen Auswüchsen in das Nährmedium. Die Bildung tiefer Kolonien geht häufig mit einem Aufbrechen des dichten Mediums einher, wenn die Mikroorganismen Gas freisetzen.
Bodenkolonien sehen normalerweise aus wie dünne transparente Filme, die über den Boden kriechen.
Die Merkmale der Kolonie können sich mit dem Alter ändern, sie hängen von der Zusammensetzung des Mediums und der Kultivierungstemperatur ab.
Das Wachstum von Mikroorganismen auf flüssigen Nährmedien wird durch vier- bis siebentägige Kulturen unter stationären Bedingungen berücksichtigt.
In flüssigen Nährmedien wird während des Wachstums von Mikroorganismen eine Trübung des Mediums, die Bildung eines Films oder Sediments beobachtet.
Beim Wachstum auf halbflüssigen (0,5-0,7 % Agar) Nährmedien verursachen mobile Mikroben eine ausgeprägte Trübung, stationäre Formen wachsen erst im Zuge der Aussaat durch Injektion in das Medium.
Das Wachstum von Mikroben geht häufig mit dem Auftreten eines Geruchs, einer Pigmentierung des Mediums und einer Gasfreisetzung einher. Der charakteristische Geruch von Kulturen einiger Bakterienarten ist mit der Bildung verschiedener Ester (Essigethyl, Essigamyl usw.), Indol, Mercaptan, Schwefelwasserstoff, Skatol, Ammoniak, Buttersäure verbunden.
Die Fähigkeit, Pigmente zu bilden, ist vielen Arten von Mikroorganismen inhärent. Die chemische Natur von Pigmenten ist vielfältig: Carotinoide, Anthocyane, Melanine. Wenn das Pigment wasserunlöslich ist, wird nur die Kulturplaque gefärbt; ist es löslich, färbt auch das Nährmedium. Es wird angenommen, dass Pigmente Bakterien vor den schädlichen Auswirkungen des Sonnenlichts schützen. Daher gibt es in der Luft so viele pigmentierte Bakterien, dass Pigmente außerdem am Stoffwechsel dieser Mikroorganismen beteiligt sind.
In der Natur gibt es sogenannte phosphoreszierende Bakterien, deren Kulturen im Dunkeln mit grünlich-bläulichem oder gelblichem Licht leuchten. Solche Bakterien kommen hauptsächlich im Fluss- oder Meerwasser vor. Zu den Leuchtbakterien – Photobakterien – zählen aerobe Bakterien (Vibrionen, Kokken, Stäbchen).
Isolierung reiner Kulturen von Mikroorganismen
Eine Reinkultur ist eine Kultur, die Mikroorganismen einer Art enthält. Die Isolierung reiner Bakterienkulturen ist ein obligatorischer Schritt der bakteriologischen Forschung in der Laborpraxis, bei der Untersuchung der mikrobiellen Kontamination verschiedener Umweltobjekte und allgemein bei jeder Arbeit mit Mikroorganismen.Das untersuchte Material (Wasser, Boden, Luft, Nahrung oder andere Gegenstände) enthält normalerweise Assoziationen von Mikroben.
Die Isolierung einer Reinkultur ermöglicht die Untersuchung morphologischer, kultureller, biochemischer, antigener und anderer Merkmale, deren Gesamtheit die Art und Art des Erregers bestimmt, also identifiziert wird.
Zur Isolierung reiner Kulturen von Mikroorganismen werden Methoden eingesetzt, die sich in mehrere Gruppen einteilen lassen:
1. Pasteur-Methode – sequentielle Verdünnung des Testmaterials in einem flüssigen Nährmedium auf eine Konzentration von einer Zelle pro Volumen (hat historische Bedeutung).
2. Kochs Methode („Plattenverdrahtung“) – sequentielle Verdünnung des Testmaterials in geschmolzenem Agar (Temperatur 48–50 °C), gefolgt vom Gießen in Petrischalen, wo der Agar erstarrt. Die Aussaat erfolgt in der Regel aus den letzten drei bis vier Verdünnungen, in denen nur wenige Bakterien vorhanden sind. Später, beim Wachstum auf Petrischalen, entstehen isolierte Kolonien, die aus einer ursprünglichen Mutterzelle gebildet werden. Aus isolierten Kolonien in der Tiefe des Agars wird durch Subkultur auf frischem Medium eine reine Bakterienkultur gewonnen.
3. Die Shukevich-Methode – wird verwendet, um eine Reinkultur von Proteus und anderen Mikroorganismen mit „schleichendem“ Wachstum zu erhalten. Die Beimpfung des Testmaterials erfolgt in Kondenswasser am Boden des Schrägagars. Bewegliche Mikroben (Proteus) können die Agarschräge hinaufsteigen, stationäre Formen bleiben am Boden, an der Aussaatstelle, und wachsen weiter. Durch Subkultivierung der Oberkanten der Kultur kann eine Reinkultur gewonnen werden.
4. Drygalskys Methode – wird in der bakteriologischen Praxis häufig verwendet, wobei das Testmaterial in einem Reagenzglas mit steriler Kochsalzlösung oder Brühe verdünnt wird. Ein Tropfen des Materials wird in den ersten Becher gegeben und mit einem sterilen Glasspatel auf der Oberfläche des Mediums verteilt. Dann wird mit demselben Spatel (ohne ihn in der Flamme des Brenners zu verbrennen) die gleiche Aussaat im zweiten und dritten Becher durchgeführt.
Mit jeder Aussaat der Bakterien auf dem Spatel werden es immer weniger und bei der Aussaat auf der dritten Tasse verteilen sich die Bakterien getrennt voneinander über die Oberfläche des Nährmediums. Nachdem die Platten 1–7 Tage lang in einem Thermostat aufbewahrt wurden (abhängig von der Wachstumsrate der Mikroorganismen), gibt jedes Bakterium auf der dritten Platte einen Zellklon ab und bildet eine isolierte Kolonie, die zu diesem Zweck auf einem Schrägagar subkultiviert wird eine reine Kultur aufbauen.
5. Weinberg-Methode. Besondere Schwierigkeiten ergeben sich bei der Isolierung reiner Kulturen obligater Anaerobier. Wenn der Kontakt mit molekularem Sauerstoff nicht sofort zum Zelltod führt, erfolgt die Aussaat nach der Drygalsky-Methode, danach werden die Becher jedoch sofort in einen Anaerostaten gestellt. Die Zuchtmethode wird jedoch häufiger verwendet. Sein Wesen liegt darin, dass die Verdünnung des Testmaterials in einem geschmolzenen und auf 45–50 °C abgekühlten Agar-Nährmedium erfolgt.
Machen Sie 6-10 aufeinanderfolgende Verdünnungen, dann wird das Medium in den Reagenzgläsern schnell abgekühlt und die Oberfläche mit einer Schicht einer Mischung aus Paraffin- und Vaselineöl bedeckt, um das Eindringen von Luft in die Dicke des Nährmediums zu verhindern. Manchmal wird das Nährmedium nach dem Beimpfen und Mischen in sterile Burri-Röhrchen oder Pasteur-Kapillarpipetten überführt, deren Enden versiegelt sind. Bei erfolgreicher Verdünnung in Reagenzgläsern, Burri-Röhrchen, Pasteurpipetten wachsen isolierte Kolonien von Anaerobiern. Damit isolierte Kolonien gut sichtbar sind, werden geklärte Nährmedien verwendet.
Um isolierte anaerobe Kolonien zu extrahieren, wird das Röhrchen durch Rotieren über der Flamme leicht erhitzt, während das an den Wänden anliegende Agar schmilzt und der Inhalt des Röhrchens in Form einer Agarsäule in eine sterile Petrischale gleitet. Die Agarsäule wird mit einer sterilen Pinzette durchtrennt und die Kolonien werden mit einer Öse entfernt. Die extrahierten Kolonien werden in ein flüssiges Medium gegeben, das die Entwicklung isolierter Mikroorganismen begünstigt. Das Agarmedium wird aus dem Burri-Röhrchen entfernt, indem das Gas durch einen Baumwollstopfen geleitet wird.
6. Hungate-Methode. Wenn man isolierte Bakterienkolonien mit besonders hoher Sauerstoffempfindlichkeit (strikte Aerobier) gewinnen möchte, kommt die Hungate-Rotationsrohrmethode zum Einsatz. Dazu wird das geschmolzene Agarmedium bei Gleichstrom durch ein Reagenzglas mit einem von Sauerstoffverunreinigungen befreiten Inertgas mit Bakterien beimpft. Dann wird das Röhrchen mit einem Gummistopfen verschlossen und horizontal in eine Klemme gelegt, die das Röhrchen dreht; Das Medium verteilt sich gleichmäßig über die Wände des Reagenzglases und verfestigt sich in einer dünnen Schicht. Die Verwendung einer dünnen Schicht in einem mit einem Gasgemisch gefüllten Reagenzglas ermöglicht die Gewinnung isolierter Kolonien, die mit bloßem Auge deutlich sichtbar sind.
7. Isolierung einzelner Zellen mittels Mikromanipulator. Mikromanipulator – ein Gerät, das die Verwendung einer speziellen Mikropipette oder Mikroschleife zum Entfernen einer Zelle aus einer Suspension ermöglicht. Dieser Vorgang wird unter einem Mikroskop kontrolliert. Auf dem Mikroskoptisch ist eine Nasskammer installiert, in die der „hängende Tropfen“ des Präparats gegeben wird. In den Halterungen von Operationsständern sind Mikropipetten (Mikroloops) befestigt, deren Bewegung im Sichtfeld des Mikroskops dank eines Systems aus Schrauben und Hebeln mikrometergenau erfolgt. Der Forscher extrahiert durch ein Mikroskop einzelne Zellen mit Mikropipetten und überführt sie in Reagenzgläser mit einem sterilen flüssigen Medium, um einen Zellklon zu erhalten.
L.V. Timoschtschenko, M.V. Chubik
Pasteur-Methode, Koch-Methode, biologisch-physikalisch
(hat historische (lamellare
Wert) Verkabelung) Shchukevich Chemische Methode
Modern
Aussaat mit Schlinge Aussaat mit Spachtel
(Drigalski-Methode)
Methoden zur Isolierung reiner Kulturen (Schema 11):
1. Mechanische Freigabemethoden basiert auf der Abtrennung von Mikroben durch sukzessives Mahlen des Testmaterials über die Oberfläche des Agars.
A) Pasteur-Methode– hat historische Bedeutung, sorgt für die gleichmäßige Verdünnung des Testmaterials in einem flüssigen Nährmedium durch das Rollverfahren
B) Koch-Methode- Methode der Plattenanordnung – basierend auf der sequentiellen Verdünnung des Testmaterials mit Fleisch-Pepton-Agar, gefolgt vom Eingießen von Reagenzgläsern mit verdünntem Material in Petrischalen
V) Drygalski-Methode- Wenn Sie reichlich mit Mikroflora besätes Material säen, verwenden Sie 2-3 Tassen für die aufeinanderfolgende Aussaat mit einem Spatel.
G) Schleifensaat mit parallelen Hüben.
2. biologische Methoden basierend auf den biologischen Eigenschaften von Krankheitserregern.
A) Biologisch- Infektion hochempfindlicher Tiere, bei der sich Mikroben schnell vermehren und ansammeln. In einigen Fällen ist diese Methode die einzige, mit der Sie die Kultur des Erregers bei einer kranken Person isolieren können (z. B. bei Tularämie), in anderen Fällen ist sie empfindlicher (z. B. die Isolierung von Pneumokokken bei weißen Mäusen). oder der Erreger der Tuberkulose bei Meerschweinchen).
B) Chemisch– basierend auf der Säureresistenz von Mykobakterien. Um das Material von der Begleitflora zu befreien, ist es
mit einer Säurelösung behandelt. Es wachsen nur Tuberkelbazillen, da die säuretoleranten Mikroben durch die Säure abgetötet werden.
V) physikalische Methode basierend auf der Hitzebeständigkeit von Sporen. Zur Isolierung von Kulturen sporenbildender Bakterien
Mischungen wird das Material auf 80°C erhitzt und auf ein Nährmedium geimpft. Es wachsen nur Sporenbakterien, weil ihre Sporen am Leben bleiben und Wachstum bewirken.
G) Shchukevichs Methode- basierend auf der hohen Beweglichkeit des vulgären Proteus, der zu schleichendem Wachstum fähig ist.
Die Methode zur Übertragung von Kolonien auf Schrägagar und BCH:
A) Übertragung von Kolonien auf Schrägagar
Der Deckel des Bechers wird leicht geöffnet, ein Teil einer einzelnen Kolonie wird mit einer kalzinierten, gekühlten Öse entnommen, ein Reagenzglas mit sterilem Schrägagar wird geöffnet und in der linken Hand schräg gehalten, so dass die Oberfläche des Medium beobachtet werden kann. Die Öse mit der Kultur wird in das Reagenzglas überführt, ohne die Wände zu berühren, über das Nährmedium gerieben, von einem Ende des Reagenzglases zum anderen über die Oberfläche gleitend und mit den Strichen bis zur Oberseite des Mediums angehoben – Aussaat mit einem Schlaganfall. Das Röhrchen wird verschlossen und ohne loszulassen werden der Name der ausgesäten Mikrobe und das Aussaatdatum unterschrieben.
B) Übertragung von der Kolonie auf Fleisch-Pepton-Brühe
Die Technik der Nachsaat auf MPB ist grundsätzlich die gleiche wie bei der Aussaat auf dichtem Substrat. Bei der Aussaat auf dem BCH wird die Schlinge mit dem Material darauf in das Medium eingetaucht. Wenn das Material zähflüssig ist und nicht aus der Schleife entfernt wird, wird es an der Gefäßwand verrieben und anschließend mit einem flüssigen Medium abgewaschen. Mit einer sterilen Pasteur- oder Messpipette gesammeltes flüssiges Material wird in ein Nährmedium gegossen.
Als Ergebnis der selbstständigen Arbeit sollte der Studierende wissen:
1. Methoden zur Isolierung einer Reinkultur von Mikroorganismen
2. Methoden zur Kultivierung von Mikroorganismen
In der Lage sein:
1. Fähigkeiten zur Einhaltung der Regeln des Antiepidemieregimes und der Sicherheitsvorkehrungen
2. Material desinfizieren, Hände behandeln
3. Bereiten Sie Präparate aus Bakterienkolonien vor
4. Mikroskopieren Sie die Kolonien
5. Gram-Färbe-Mikroorganismen
AKTIVITÄT 8
THEMA. Methoden zur Isolierung reiner Kulturen (Fortsetzung). Enzymatische Aktivität von Bakterien und Methoden zu ihrer Untersuchung.
Eine Reinkultur ist eine Ansammlung von Mikroorganismen derselben Art. Die Beschaffung dieses Materials ist ein notwendiger Forschungsschritt bei der Umsetzung labordiagnostischer Techniken. Zur Isolierung reiner Bakterienkulturen werden Abstriche aus Blut, Sputum, Kot verwendet, eitriges sowie anderes biologisches Material untersucht. Unter natürlichen Bedingungen (in der Luft, im Wasser, im Boden), in Nahrungsmitteln und in Leichen (Mensch, Tier) sind Verbände verschiedener Arten von Mikroorganismen enthalten.
Die Trennung der Reinkultur ist wichtig für eine detaillierte Untersuchung der Eigenschaften von Mikroben: morphologisch, kulturell, biochemisch und auch antigenisch. Basierend auf den Ergebnissen dieser Forschungsmethoden ist es möglich, die Zugehörigkeit des Erregers zu einer bestimmten Art und Art festzustellen, also zu identifizieren.
Die Prinzipien der biologischen Trennung von Bakterien beinhalten die Berücksichtigung der Merkmale der lebenswichtigen Aktivität von Mikroben, um die optimalsten Forschungsmethoden auszuwählen. Die gewählten Methoden müssen in bestimmten Parametern zum Erreger passen.
- Atemtyp. Unter den Bakterien werden Gruppen aerober und anaerober Vertreter unterschieden. Um anaerobe Mikroben zu gewinnen, wird das Forschungsmaterial erhitzt. Der nächste Schritt ist die Kultivierung der Mikrobe unter anaeroben Bedingungen. Die Methoden zur Gewinnung aerober und anaerober Bakterien sind unterschiedlich.
- Sporulation. Die Fähigkeit einiger Bakterien zur Sporenbildung gewährleistet den Schutz und die Sicherheit von Mikroorganismen.
- Die Widerstandsfähigkeit von Bakterien gegenüber der aggressiven Wirkung von Laugen und Säuren. Die Resistenz einiger Bakterienarten gegenüber diesen Substanzen gewährleistet eine maximale Reinigung des Testmaterials von der Beimischung anderer Bakterien durch alkalische oder saure Lösungen.
- Mobilität bakterieller Organismen. Um eine Reinkultur beweglicher Mikroorganismen zu trennen, werden Methoden zur Trennung von Mikrobenkulturen in einem Kondensattropfen verwendet.
- Anfälligkeit von Mikroorganismen gegenüber Antibiotika, bestimmten Chemikalien und anderen antimikrobiellen Wirkstoffen. Für einige Krankheitserreger werden Kulturisolationsmethoden unter Verwendung selektiver (spezifischer) Nährmedien am meisten bevorzugt.
- Antibiotika. Reinigen Sie das Material von zusätzlichen Mikroorganismen.
- Die Fähigkeit von Bakterien, in die intakte Haut einzudringen. Diese Eigenschaft ist einigen Sorten eigen, die Aggressionsfaktoren aufweisen.
- Anfälligkeit von Tieren für bestimmte Krankheiten infektiösen Ursprungs.
Methoden zur Beurteilung von Krankheitserregern
Um Reinkulturen von Bakterienzellen zu gewinnen, kommen verschiedene Methoden zum Einsatz. Jeder von ihnen wird in einer bestimmten Situation eingesetzt und verfügt über aufeinanderfolgende klare Schritte zur Gewinnung von Kolonien des Erregers. Betrachten Sie die beliebtesten.
Pasteur-Technik
Hierbei handelt es sich um die Verdünnung reiner Kulturen in Bakterienwachstumsmedium (flüssige Konsistenz) auf eine Konzentration von 1 Zelle pro Flüssigkeitsvolumen. Diese Auswahlmethode ist von großer historischer Bedeutung.
Kochs Technik
Auch als „Teller-Spread“-Technik bekannt. Es handelt sich um eine Verdünnung des Forschungsmaterials in Agar (im geschmolzenen Zustand mit einer Temperatur von 48–50 °C). Als nächstes wird die resultierende Zusammensetzung in Petrischalen gegossen, wo sie sich verfestigen sollte.
Die Anzucht erfolgt in der Regel ab den letzten 3-4 Verdünnungen, da dort bereits wenige Bakterien vorhanden sind. So entstehen beim Wachstum von Mikroben auf einem Nährmedium isolierte Kolonien von Mikroorganismen, die aus einer einzigen Mutterzelle entstehen. Anschließend kann eine isolierte Kolonie aus der Tiefe des Agars ausgewählt und auf ein frisches Nährmedium übertragen werden. Der nächste Schritt ist die Identifizierung und Isolierung des Erregers.
Shukevichs Technik
Es wird verwendet, wenn eine Reinkultur von Proteus aerobes oder anderen Mikroben mit „schleichendem“ Wachstum isoliert werden muss. Pflanzen Sie die Kulturen in kondensiertes Wasser am Boden des Schrägagars.
Bei dieser Methode zur Trennung einer Reinkultur steigen mobile Zellorganismen (Proteus) an die Spitze der Agarschräge und unbewegliche Formen ändern ihre Position auf dem Saatmedium nicht. Durch Subkultivierung der oberen Ränder der gekeimten Kultur kann eine reine Bakterienkultur gewonnen werden.
Drygalskys Technik
Die Drygalsky-Methode wird häufig bei der Untersuchung biologischen Materials verwendet, indem Kulturen in einem Reagenzglas mit Brühe oder Kochsalzlösung verdünnt werden.
Der nächste Schritt: Ein Tropfen der resultierenden Lösung wird mit einem sterilen Glasspatel gleichmäßig auf der Oberfläche des Nährmediums in der 1. Tasse verteilt. Dann, ohne den Spatel auf dem Feuer zu verbrennen, führen wir die gleiche Aussaat in der 2. und 3. Schüssel durch. Das Wesen der Drygalsky-Methode besteht darin, dass mit jeder weiteren Aussaat von Kulturen die Konzentration an Bakterien (Aerobier) immer geringer wird. Auf der 3. Platte sind sie weit auseinander verteilt, aus jeder Bakterienzelle entstehen klonale Zellen (in Form einer isolierten Kolonie). Zur Anreicherung von Krankheitserregern werden sie auf Schrägagar subkultiviert.
Weinberg-Technik
Die Isolierung reiner Kulturen anaerober Krankheitserreger bereitet gewisse Schwierigkeiten, wenn die Mikroorganismen nicht durch Kontakt mit Sauerstoffmolekülen absterben. Der Kern der Technik besteht darin, anaerobe Mikroben (in der Zusammensetzung des Materials) in einem leicht gekühlten (45-50 ° C) geschmolzenen Nährmedium (agarosisiert) zu entfernen. Verbringen Sie 6-10 Verdünnungen. Dann kommt der nächste Schritt: Es ist notwendig, die Zusammensetzung im Reagenzglas schnell abzukühlen und ihre Oberfläche mit einer Mischung aus Vaseline und Paraffinöl zu füllen, die das Eindringen von Luft verhindert und die Entwicklung anaerober Bedingungen fördert.
Bei günstiger Aussaat keimen am zweiten Tag vereinzelte Kolonien, die durch Erhitzen mit einem Brenner aus dem Röhrchen entfernt werden können. Die Kulturen werden zur weiteren Untersuchung von der geschnittenen Agarsäule entnommen. Die resultierenden Kolonien werden in ein flüssiges Nährmedium gegeben, in dem die Schritte zur Isolierung der Kolonie von anaeroben Krankheitserregern abgeschlossen werden können.
Hungate-Technik
Es wird häufig zur Isolierung aerober Mikroben mit hoher Sauerstoffempfindlichkeit eingesetzt. Bei der Durchführung einer solchen Isolierung der Aerobierkultur wird die Technik rotierender Reagenzgläser verwendet.
Methoden zur Inokulation aerober Bakterien umfassen deren Züchtung auf einem geschmolzenen Agarmedium. Das Vorhandensein eines Inertgases in einem Reagenzglas ermöglicht es, isolierte Säulen aerober Bakterien so zu züchten, dass die isolierten Kulturen aerober Bakterien 2-3 Tage lang auch mit bloßem Auge deutlich sichtbar sind.
Mikromanipulator
Hierbei handelt es sich um eine Technik zur Isolierung einzelner Bakterienzellen mithilfe eines Mikromanipulators. Der Mikromanipulator ist ein spezielles Gerät, das eine Zelle aus einer Suspension auffangen kann und außerdem die Möglichkeit bietet, eine Kultur in einem Reagenzglas auszusäen.
Die weitere Identifizierung des Erregers erfolgt unter Berücksichtigung aller aufgeführten Eigenschaften des Erregers (Aerobier und Anaerobier) sowie der Besonderheiten ihrer Wechselwirkung mit verschiedenen Substanzen.
