Rationales Design von Proteinmolekülen. Anwendung des Protein-Engineerings. Welche Ausdruckssysteme kennen Sie?

Dictionary Elution Elution ist eine Methode zur Extraktion einer Substanz (Virus) aus einem festen Träger durch Auswaschen. Display-Methode Die Display-Methode ist eine Methode zur Präsentation heterologer Proteine/Peptide auf der Oberfläche von Viren, Zellen oder zellfreien Kulturen, um Proteine oder Peptide auszuwählen mit den erforderlichen Eigenschaften Biosensor Biosensor - Analysesystem (biologisches Material + Konverter Elution Elution ist eine Methode zur Extraktion einer Substanz (Virus) aus einem festen Träger durch Auswaschen. Display-Methode Display-Methode ist eine Methode zur Präsentation heterologer Proteine/Peptide auf der Oberfläche von Viren, Zellen oder zellfreien Eigenschaften Biosensor Biosensor ist ein Analysesystem (biologisches Material + Wandler), das es ermöglicht, Substanzen in der Testprobe nachzuweisen und deren Konzentrationen abzuschätzen

Protein-Engineering 4 Eine Reihe von Methoden und Ansätzen zur Untersuchung von Proteinen und zur Gewinnung von Proteinen mit neuen Eigenschaften. HAUPTZIELE: Erstellen einer Bibliothek von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen. Untersuchen Sie die Auswirkungen von Substitutionen einzelner Aminosäurereste auf die Proteinfaltung und -funktion. Entwickeln Sie Methoden zur effizienten Modifikation von Proteinen um ihnen die notwendigen Eigenschaften zu verleihen. Entwickeln Sie Methoden und Ansätze für das Screening und die Auswahl von Proteinen mit den gewünschten Eigenschaften

Rationales Design Rationales Design Der Bedarf an Wissen über die räumliche Organisation des Proteins Der Bedarf an Wissen über intra- und intermolekulare Wechselwirkungen Unvollkommene Methoden und Geräterichtung, die darauf abzielen, durch ihr räumliches Design neue Proteine de novo zu schaffen

Gezielte Evolution von Proteinmolekülen ist eine Richtung, die auf die Schaffung neuer Proteine durch Selektion abzielt: 1. Gewinnung von Klonbibliotheken zufälliger Aminosäuresequenzen, 2. Auswahl von Polypeptidketten, die zumindest einen geringen Grad der gewünschten Eigenschaften aufweisen, 3. Verwendung von Zufallsmutagenese, um neue Proteinklonbibliotheken zu erhalten, die verwendet werden in der nächsten Selektionsrunde oder unter Verwendung gentechnisch veränderter Konstrukte, die neue Proteine exprimieren

Направленная эволюция белковых молекул (варианты) рациональный редизайн с помощью направленного мутагенеза заменяют конкретные аминокислотные остатки в активном центре фермента инженерия белковых поверхностей с помощью мутаций изменяют участки полипептидной цепи в окрестностях аминокислотных остатков, сближенных на поверхности белковой глобулы, но находящихся в полипептидной цепи на значительном расстоянии gegenseitig

Screening und Auswahl von Proteinen mit Zieleigenschaften Zufälliges Screening Verbesserte Screening-Auswahl Jedes Protein wird auf die gewünschten Eigenschaften getestet; die Auswahl der Proteine aus der Bibliothek erfolgt zufällig; jedes Protein wird auf das Vorhandensein der erforderlichen Eigenschaften untersucht; Die Auswahl von Proteinen aus der Bibliothek ist zufällig möglich, wenn sich die Objekte, aus denen die Bibliothek besteht, phänotypisch unterscheiden (z. B. durch das Vorhandensein enzymatischer Aktivität). Bedingungen für die selektive Erhaltung der Bibliothekskomponenten mit bestimmten Eigenschaften (Phagen, Zelle) werden geschaffen (Display) Es werden Bedingungen für die selektive Konservierung der Bibliothekskomponenten geschaffen, die bestimmte Eigenschaften aufweisen (Phagen-, Zelldisplay). Nachweis eines Proteins mit den erforderlichen Eigenschaften unter einer großen Anzahl von Makromolekülen, aus denen die resultierende Klonbibliothek besteht

Phagendisplay Zweck: Fremdproteine auf der Oberfläche des Phagen freilegen. Die Methode wurde 1985 für den filamentösen Bakteriophagen M13 entwickelt. (Die pIII- und pVIII-Gene sind geeignete Zielstellen für die Insertion eines fremden cDNA-Fragments.) Ziel ist es, fremde Proteine auf der Oberfläche des Phagen freizulegen. Die Methode wurde 1985 für den filamentösen Bakteriophagen M13 entwickelt. (Die pIII- und pVIII-Gene sind geeignete Zielstellen für die Insertion eines fremden cDNA-Fragments) Konstruieren Sie ein Hybridgen, das aus den kodierenden Sequenzen des Zielproteins und einem der Phagenhüllproteine besteht, wobei Bakteriophagen E. coli während der Phagenassemblierung mit Hybridproteinen infizieren in das Phagenpartikel eingebaut

Phagemid-Helferphage Phagengenom Infektion von E. coli mit Helferphagen-Plasmidbibliothek/Phagemid-transformierten E. coli-Zellen werden mit Helferphagen infiziert, um Phagenpartikel zu produzieren, die mit verschiedenen Zielproteinvarianten der Plasmidbibliothek/Phagemid-transformierten E. coli-Zellen oberflächenexponiert sind. werden mit einem Helferphagen infiziert, um Phagenpartikel zu erhalten, auf deren Oberfläche verschiedene Varianten des Zielproteins freigelegt werden

Perspektiven für den praktischen Einsatz des Protein-Engineerings in der Medizin: *zur Gewinnung neuer Medikamente; für die Entwicklung diagnostischer Instrumente und die Herstellung von Impfstoffen; *Um die Mechanismen der Immunantwort sowie Erkrankungen des Immunsystems zu untersuchen. Ökologie: *Um Biokatalysatoren in Form ganzer Zellen mit auf ihrer Oberfläche immobilisierten Enzymen zu erhalten; *zur Beschaffung von Biosensoren zum Zwecke der Diagnostik und Überwachung der Umwelt; *zur Herstellung von Bioadsorbentien, um Giftstoffe und Schwermetallionen aus der Umwelt zu entfernen

Messung von Glukose mit einer Enzymelektrode (schematische Darstellung des Experiments von L. Clark). Oxidation von Glucose durch das Enzym Glucoseoxidase in Gegenwart von Sauerstoff: Glucose + O 2 H 2 O 2 + Glucono-1,5-lacton. H 2 O 2 wird an einer Platinelektrode bei einem Potential von +700 mV reduziert; Der im Stromkreis fließende Strom ist proportional zur Konzentration von Wasserstoffperoxid (d. h. indirekt von Glukose).

Wörterbuch Immobilisierung Immobilisierung ist eine Einschränkung der Beweglichkeit von Molekülen und deren Bestätigung Umlagerungen Aerotank Aerotank ist ein Abwasserbehandlungssystem, Tanks, in denen WW, mikrobieller Schlamm und Luft gemischt werden, um Wasser, Boden und Atmosphäre unter Verwendung des Stoffwechselpotentials biologischer Objekte – Pflanzen – zu reinigen , Pilze, Insekten, Würmer und andere Organismen Immobilisierung Immobilisierung ist die Einschränkung der Beweglichkeit von Molekülen und deren Bestätigung Umlagerungen und Luft Methantank Methantank ist ein Reservoir für die biologische Verarbeitung organischer Schadstoffe mit Hilfe von Bakterien unter anaeroben Bedingungen Bioremediation Bioremediation ist eine Reihe von Methoden zur Reinigung von Wasser, Boden und Atmosphäre unter Nutzung des Stoffwechselpotenzials biologischer Objekte – Pflanzen, Pilze, Insekten, Würmer und andere Organismen

Klassifizierung von Enzymen Klasse Katalysierte Reaktionen Beispiele für Enzyme Oxidoreduktasen Reduktive und oxidative Reaktionen Es sind mehr als 200 Enzyme bekannt. Katalase, Glucoseoxidase Transferasen Reversibler Transfer von Atomgruppen von Donoren zu Akzeptoren. Es sind mehr als 450 Enzyme bekannt. Pyruvatkinase, Proteinkinase Hydrolasen Hydrolysereaktionen Es sind mehr als 200 Hydrolasen bekannt. Protease-, Amylase-, Cellulase-Lyasen Nichthydrolytische Abspaltung von Atomgruppen vom Substrat unter Bildung von Doppelbindungen. Es sind mehr als 100 Lyasen bekannt. Aspartase, Fumarase Isomerasen Intramolekulare Umlagerungsreaktionen organischer Verbindungen Es sind mehr als 50 Enzyme bekannt. Glucoseimerase-Ligasen Bindungsreaktionen zweier verschiedener Moleküle aneinander Mehr als 100 sind bekannt. DNA-Ligase, Tryptophan-Synthetase

Mikroorganismen Quellen von Enzymen Bazillen sind Biosynthesizer von Ribonukleasen, Desoxyribonukleasen und Proteasen, während Hefen Biosynthesizer von Glucoamylasen, Invertasen und saurer Phosphatase sind. Pflanzenamylase wird aus Gerste, saure Phosphatase aus Kartoffeln und Meerrettichperoxidase isoliert. Tiere. Laktatdehydrogenase wird aus dem Herzen von Rindern isoliert. Aus dem Magen wird alkalische Phosphatase isoliert. Zur Gewinnung von Pepsin wird der Magen von Schweinen verwendet. Aus dem Herzen von Rindern wird Laktatdehydrogenase und aus dem Magen alkalische Phosphatase isoliert. Zur Herstellung von Pepsin wird Schweinemagen verwendet

Immobilisierungsmethoden Physikalische Methoden Chemische Methoden Adsorption an einem unlöslichen Träger, Einbau in Gelporen, räumliche Trennung mithilfe einer semipermeablen Membran und andere basieren auf der Schaffung neuer kovalenter Bindungen zwischen dem Enzym und dem Träger

Die Vorteile immobilisierter Enzyme bestehen darin, dass sie die Enzyme vom Reaktionsmedium trennen, die Reaktion zum richtigen Zeitpunkt stoppen und ein Produkt erhalten, das nicht mit dem Enzym verunreinigt ist; Führen Sie den Prozess im kontinuierlichen Modus durch und kontrollieren Sie die Reaktionsgeschwindigkeit. die Eigenschaften des Katalysators, seine Spezifität, Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen und Empfindlichkeit gegenüber denaturierenden Effekten verändern; regulieren die katalytische Aktivität des Enzyms durch Einwirkung auf den Träger

Enzyme in der biotechnologischen Produktion Enzymquelle, Immobilisierungsmethode Biotechnologie Acetylneutraminat-9-Phosphat-Synthase Enzym E. coli. Einarbeitung in Polyacrylamidgel. Synthese von Sialinsäuren. Peroxidase Ein Enzym aus Meerrettich. Copolymerisation und Einarbeitung in das Alginat-Gel. Oxidation von Phenol im Abwasser. 3-Ketosteroid-Dehydrogenase-Zellen von Mycobacterium globiformis. Einarbeitung in Polyacrylamidgel. Umwandlung von Hydrocortison in Prednisolon

Lavryashina M.B. KemSU Methoden der ökologischen Biotechnologie Biologische Abwasserbehandlung Bio(phyto)sanierung Herstellung biosicherer Insektizide und Herbizide Herstellung biosicherer Insektizide und Herbizide Gewinnung sauberer Energie Schaffung krankheitsresistenter landwirtschaftlicher Pflanzen Bakterielle Auswaschung von Metallen Klonen gefährdeter und ausgestorbener Tierarten

Abwasserbehandlungsmethoden Mechanisch (Absetzen, Filtern) Mechanisch Chemisch (Einwirkung durch Reagenzien) Chemisch Physikalisch und chemisch Biologisch (biochemische Selbstreinigung)) Biologisch Das wichtigste Problem der Biotechnologie ist die Abwasserbehandlung

Aerotanks arbeiten in Kombination mit einem Ausgleichsbehälter, Absetzbecken, einem Schlammregenerator und einem Schlammverdichter (Presse). Aerotank Aerotank

Methantank Methantank (von Methan und englisch Tank - Tank, Zisterne) Bakteriengruppen Ausgangsstoffe Produkte HYDROLYTISCH ACETOGEN Organische Schadstoffe Höhere Fettsäuren WASSERSTOFF HERSTELLEN Höhere Fettsäuren H 2, CO 2, CH 3 COOH METHANERZEUGENDES H 2, CO 2 , CH 3 COOH CH 4, CO 2

Phasen der Methanfermentation 1 Polymerbiohydrolyse und Acidogenese (organische Substanzen werden in höhere Fettsäuren, Acetat und Wasserstoff umgewandelt) 2 Acetogenese und Dehydrierung (Acetogenese und Wasserstoff werden aus höheren Fettsäuren gebildet) 3 Methanogenese (Methan, Wasserstoff und Kohlendioxid werden gebildet aus Acetat)

Ich phasenweise. ZELLULOSE-ENTWICKLUNG (Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens) PROTEOLITISCH PROTEOLITISCH (Clostridium, Petrococcus) Phase II. ACETOGEN (Syntrophobacter wolinii) Phase III. METHANO-GENERATOREN (Metanobacterium thermoautotrophicum, Methanococcus vannielii) Beispiele für Mikroorganismen

BIOREMEDIATION Die Methode basiert auf der Fähigkeit von Mikroorganismen, komplexe organische Substanzen zu nutzen und sie in einfache „biologisch sichere“ Substanzen zu zerlegen. Molekularbiologie und Genetik, Ökologie, Ingenieurwissenschaften, Mikrobiologie, BIOREMEDIATION

Bioremediation. Ansätze. Nutzung der Aktivität natürlicher „wilder“ Mikroorganismen Nutzung der Aktivität natürlicher „wilder“ Mikroorganismen (ein Verstärker ist erforderlich, zum Beispiel O 2) Verwendung aktiver Stämme, die in Form von biologischen Produkten an Orten mit starker Verschmutzung eingeführt werden

Untersuchung der Biodiversität kontaminierter Gebiete. Isolierung der Mikroflora, die entfernte Schadstoffe zerstören kann. Aktivierung der lokalen Mikroflora (Biostimulation). Einführung spezieller Mikroorganismen-Zerstörer in kontaminierte Bereiche (Bioremediation) Bioremediation. Stufen.

SCHADSTOFFE Chemische Analyse Technische Technologien Biostimulation (natürliche mikrobielle Gemeinschaften) Biostimulation Bioremediation (Künstliche mikrobielle biologische Produkte) Bioremediation Überwachung der Bioremediation Biophytoremediation (Gemeinschaften von Pflanzen und Mikroorganismen) Biophytoremediation

Konstruktion von transgenen Pflanzen, die gegen Insektenschädlinge resistent sind. 1. SYNTHESE SPEZIFISCHER TOXINE. 2. SYNTHESE HYDROLYTISCHER ENZYME, DIE DIE ZELLWÄNDE VON INSEKTENLARVEN UND ANDEREN SCHÄDLINGEN UND KRANKHEITEN BEEINFLUSSEN /CHITINASE, -1,3- GLUCONASE, PR-PROTEINE / 3. SYNTHESE PROTEINASE-INHIBITOREN UND INHIBITOREN PFLANZLICHER POLYSACCHARID-ENZYME 4. MODIFIKATION DES PFLANZLICHEN SEKUNDÄRSTOFFWECHSELS FÜR: A) BEGRENZUNG NOTWENDIGER SUBSTANZEN B) SYNTHESE NEUER REPELLENTIEN UND TOXINE 5. REGULIERUNG DER SCHUTZANTWORT: A) DIGITALE GEN-EXPRESSION von TissueSpe B) REGULIERUNG DER GEN-EXPRESSION DURCH VERSCHIEDENE NATÜRLICHE UND KÜNSTLICHE FAKTOREN Erhöhte Resistenz transgener Pflanzen gegen den Pilzpathogen Phomopsis helianhi Erhöhte Resistenz transgener Pflanzen gegen den Pilzpathogen Phomopsis helianhi A B A – nicht transgene Pflanze B – transgene Pflanze A – nicht transgene Pflanze B – transgene Pflanze

Ungefähre Liste der Themen, die in der Leistungsprüfung enthalten sind: 1. Geschichte der Biotechnologie. Merkmale historischer Epochen. Die bedeutendsten Entdeckungen, die eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Wissenschaft spielten. 2. Allgemeine Konzepte der Biotechnologie: biotechnologisches System, biotechnologischer Prozess, biotechnologisches Objekt. 3. Biotechnologische Objekte, Definition, Charakterisierung der Stellung eines Bioobjekts in einem biotechnologischen System, Klassifizierung, Beispiele praktischer Anwendung. 4. Mikroorganismen als biologische Objekte. Beispiele, praktischer Einsatz in der Biotechnologie. 5. Zell- und Gewebekulturen als biologische Objekte. Beispiele, praktischer Einsatz in der Biotechnologie. 6. Biotechnologischer Prozess. Stufen. Kurze Beschreibung der Phasen des biotechnologischen Prozesses. 7. Eigenschaften von Mikroorganismen als Selektionsobjekte. Auswahl von Mikroorganismen in der Biotechnologie. 8. Mutagenese: Definition, Formen der Mutagenese, mutagene Faktoren. 9. Auswahl mutierter Mikroorganismen, die im Selektionsprozess in der Vorbereitungsphase des biotechnologischen Prozesses entstanden sind. 10. Auswahl biologischer Objekte. Stufen, Ansätze, Methoden.

11. Gentechnik: Zweck, Technik, biologische Objekte, Beispiele praktischer Anwendung, moderne Errungenschaften. 12. Enzyme der Gentechnik. Klassifizierung, Eigenschaften katalysierter Reaktionen. 13. Methoden zur Gewinnung eines Gens in der Gentechnik. Kurzbeschreibung, Vor- und Nachteile der Methoden. 14. Vektoren in der Gentechnik. Definition, Klassifizierungen, Anforderungen, Kurzbeschreibung von Vektoren. 15. Rekombinante DNA. Definition, Zweck, Methoden zur Gewinnung rekombinanter DNA in der Gentechnik. 16. Methoden zur Einführung rekombinanter DNA in eine Empfängerzelle und zur Auswahl modifizierter Zellen in der Gentechnik. 17. Pflanzentransgenese. Vektor. Grundlegende Strategien. Methoden zur Einführung von Transgenen und zur Auswahl transgener Organismen. 18. Tiertransgenese. Vektor. Grundlegende Strategien. Methoden zur Einführung von Transgenen und zur Auswahl transgener Organismen. 19. Zelltechnik: Zweck, Technik, biologische Objekte, Beispiele praktischer Anwendung, moderne Errungenschaften. 20. Methoden zur Kultivierung von Pflanzenzellen und -geweben. Kultivierungsbedingungen, Klassifizierung und kurze Charakteristika von Pflanzenkulturen in der Zelltechnik

21. Somatische Pflanzenhybriden. Produktionstechnik, moderne Errungenschaften, Beispiele praktischer Anwendung. 22. Protoplasten: Definition, Verwendung in der Zelltechnik, Methoden und Bedingungen zur Isolierung von Protoplasten. 23. Kultivierung und Fusion von Protoplasten in der Zelltechnik. Methoden, Bedingungen, Fusogene. 24. Praktischer Einsatz von Zellkulturen und Pflanzengeweben. Biosynthese und Biotransformation, Mikrovermehrung, Beispiele transgener Pflanzen mit wertvollen Eigenschaften. 25. Tierzelltechnik. Methoden, Objekte, Technik, moderne Errungenschaften, praktische Anwendung. 26. Zell- und Gewebekulturen von Tieren. Klassifizierung von Kulturpflanzen, Anbaubedingungen, Medien, Methoden zur Gewinnung somatischer Hybriden, praktische Anwendung. 27. Stammzellen. Charakteristisch. Einstufung. Bewerbungsaussichten. 28. Klonen. Methodenmerkmal. Einstufung. Bewerbungsaussichten. 29. Biotechnologischer Prozess. Kultivierungsphase. Hauptschritte, Charakterisierung von Medien für Mikroorganismen, pflanzliche und tierische Zellen. Ausrüstung. 30. Biotechnologischer Prozess. Kultivierungsphase. Arten der Kultivierung biologischer Objekte. Phasen des Kulturwachstums in einem Bioreaktor, Synthese des Zielprodukts.

31. Biotechnologischer Prozess. Die Phase der Produktbeschaffung. Die Hauptstufen und Methoden der Trennung und Reinigung eines biotechnologischen Produkts. Beispiele für Biotech-Produkte. 32. Ökologische Biotechnologie: Zweck, Methoden, biologische Objekte, Beispiele praktischer Anwendung, moderne Errungenschaften. 33. Ökologische Biotechnologie. Das Problem des Trinkwassers. Aerobe Abwasserbehandlungsmethoden. 34. Ökologische Biotechnologie. Das Problem des Trinkwassers. Anaerobe Abwasserbehandlungsmethoden. 35. Ökologische Biotechnologie. Bioremediation, Biophytoremediation. 36. Biotechnologie: Zweck, Thema, Aufgaben, Hauptrichtungen der Biotechnologie. Moderne Errungenschaften auf dem Gebiet der Biotechnologie. 37. Technische Enzymologie. Zweck, Probleme. Perspektiven. Quellen für Enzyme. 38. Immobilisierte Enzyme. Vorteile, Immobilisierungsmethoden. 39. Immobilisierte Enzyme. Träger zur Immobilisierung, praktische Anwendung. 40. Protein-Engineering. Richtungen, Methoden, Perspektiven.

Protein-Engineering ist ein Zweig der Biotechnologie, der sich mit der Entwicklung nützlicher oder wertvoller Proteine beschäftigt. Dies ist eine relativ neue Disziplin, die sich auf die Untersuchung der Proteinfaltung und der Prinzipien der Proteinmodifikation und des Proteindesigns konzentriert.

Es gibt zwei Hauptstrategien für das Protein-Engineering: gerichtete Proteinmodifikation und gerichtete Evolution. Diese Methoden schließen sich nicht gegenseitig aus; Forscher nutzen oft beides. In Zukunft könnten detailliertere Kenntnisse über die Struktur und Funktion von Proteinen sowie Fortschritte in der Hochtechnologie die Möglichkeiten des Protein-Engineerings erheblich erweitern. Dadurch können dank einer neuen Methode, die es ermöglicht, neue Aminosäuren in den genetischen Code aufzunehmen, auch nicht-natürliche Aminosäuren einbezogen werden.

Die Proteintechnik entstand an der Schnittstelle von Proteinphysik, Chemie und Gentechnik. Es löst das Problem der Schaffung modifizierter oder hybrider Proteinmoleküle mit gewünschten Eigenschaften. Ein natürlicher Weg, eine solche Aufgabe umzusetzen, besteht darin, die Struktur des Gens, das das modifizierte Protein kodiert, die Durchführung seiner Synthese, Klonierung und Expression in Empfängerzellen vorherzusagen.

Die erste kontrollierte Modifikation eines Proteins wurde Mitte der 1960er Jahre von Koshland und Bender durchgeführt. Um die Hydroxylgruppe im aktiven Zentrum der Protease Subtilisin durch eine Sulfhydrylgruppe zu ersetzen, nutzten sie die Methode der chemischen Modifikation. Es stellte sich jedoch heraus, dass ein solches Thiolsubtilisin die Proteaseaktivität nicht beibehält.

Protein ist chemisch gesehen ein Molekül desselben Typs, bei dem es sich um eine Polyaminosäurekette oder ein Polymer handelt. Es besteht aus Aminosäuresequenzen von 20 Typen. Nachdem die Menschen die Struktur von Proteinen kennengelernt hatten, stellten sie sich die Frage: Ist es möglich, völlig neue Aminosäuresequenzen so zu entwerfen, dass sie die Funktionen, die ein Mensch braucht, viel besser erfüllen als gewöhnliche Proteine? Für diese Idee entstand der Name Protein Engineering.

Bereits in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts begannen sie, über eine solche Technik nachzudenken. Dies geschah unmittelbar nach der Entschlüsselung der ersten Protein-Aminosäuresequenzen. In vielen Laboratorien der Welt wurde versucht, die Natur zu duplizieren und absolut willkürlich gegebene Polyaminosäuresequenzen chemisch zu synthetisieren.

Dies gelang vor allem dem Chemiker B. Merrifield. Dem Amerikaner gelang es, eine äußerst effiziente Methode zur Synthese von Polyaminosäureketten zu entwickeln. Dafür erhielt Merrifield 1984 den Nobelpreis für Chemie.

Abbildung 1. Funktionsschema des Protein-Engineerings

Der Amerikaner begann mit der Synthese kurzer Peptide, darunter Hormone. Gleichzeitig baute er einen Automaten – einen „chemischen Roboter“ – dessen Aufgabe es war, künstliche Proteine herzustellen. Der Roboter sorgte in wissenschaftlichen Kreisen für Aufsehen. Es wurde jedoch schnell klar, dass seine Produkte nicht mit dem konkurrieren konnten, was die Natur hervorbrachte.

Der Roboter konnte die Aminosäuresequenzen nicht exakt reproduzieren, das heißt, sie war falsch. Er synthetisierte eine Kette mit einer Sequenz und die andere mit einer leicht modifizierten. In einer Zelle sind im Idealfall alle Moleküle eines Proteins einander ähnlich, das heißt ihre Sequenzen sind exakt gleich.

Es gab auch ein anderes Problem. Selbst die Moleküle, die der Roboter korrekt synthetisierte, nahmen nicht die räumliche Form an, die für die Funktion des Enzyms notwendig ist. So hat der Versuch, die Natur durch die üblichen Methoden der organischen Chemie zu ersetzen, nur zu sehr bescheidenen Erfolgen geführt.

Wissenschaftler mussten von der Natur lernen und nach den notwendigen Modifikationen von Proteinen suchen. Der Punkt hierbei ist, dass es in der Natur ständig zu Mutationen kommt, die zu einer Veränderung der Aminosäuresequenzen von Proteinen führen. Wenn wir Mutanten mit den notwendigen Eigenschaften auswählen, die dieses oder jenes Substrat effizienter verarbeiten, ist es möglich, aus einem solchen Mutanten ein verändertes Enzym zu isolieren, wodurch die Zelle neue Eigenschaften erhält. Aber dieser Prozess dauert sehr lange.

Mit dem Aufkommen der Gentechnik änderte sich alles. Dank ihr begannen sie, künstliche Gene mit beliebiger Nukleotidsequenz zu schaffen. Diese Gene wurden in vorbereitete Vektormoleküle eingefügt und diese DNAs wurden in Bakterien oder Hefe eingeschleust. Dort wurde dem künstlichen Gen eine Kopie der RNA entnommen. Dadurch wurde das gewünschte Protein hergestellt. Fehler in der Synthese wurden ausgeschlossen. Die Hauptsache bestand darin, die richtige DNA-Sequenz auszuwählen, und dann erledigte das Enzymsystem der Zelle selbst seine Aufgabe einwandfrei. Daraus können wir schließen, dass die Gentechnik den Weg für Protein-Engineering in ihrer radikalsten Form geebnet hat.

Protein-Engineering-Strategien

Gezielte Proteinmodifikation. Bei der gezielten Veränderung eines Proteins nutzt der Wissenschaftler detaillierte Kenntnisse über die Struktur und Funktion des Proteins, um die gewünschten Veränderungen herbeizuführen. Generell hat diese Methode den Vorteil, dass sie kostengünstig und technisch unkompliziert ist, da ortsspezifische Mutagenesetechniken gut entwickelt sind. Der Hauptnachteil besteht jedoch darin, dass häufig Informationen über die detaillierte Struktur eines Proteins fehlen, und selbst wenn die Struktur bekannt ist, kann es sehr schwierig sein, die Auswirkungen verschiedener Mutationen vorherzusagen.

Softwarealgorithmen zur Proteinmodifikation zielen darauf ab, neue Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die wenig Energie benötigen, um eine vorgegebene Zielstruktur zu bilden. Obwohl die zu findende Sequenz groß ist, besteht die größte Herausforderung bei der Proteinmodifikation darin, die optimale Sequenz im Gegensatz zu ähnlichen suboptimalen Sequenzen schnell und dennoch präzise zu identifizieren und zu bestimmen.

Gerichtete Evolution. Bei der gerichteten Evolution wird eine zufällige Mutagenese auf ein Protein angewendet und eine Selektion durchgeführt, um Varianten auszuwählen, die bestimmte Eigenschaften aufweisen. Weitere Mutations- und Selektionsrunden werden angewendet. Diese Methode ahmt die natürliche Evolution nach und liefert im Allgemeinen hervorragende Ergebnisse für gezielte Modifikationen.

Eine zusätzliche Technik, bekannt als DNA-Shuffling, mischt und bringt Teile erfolgreicher Varianten hervor, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Dieser Prozess ahmt die Rekombinationen nach, die auf natürliche Weise bei der sexuellen Fortpflanzung auftreten. Der Vorteil der gerichteten Evolution besteht darin, dass keine Vorkenntnisse über die Proteinstruktur erforderlich sind und auch nicht erforderlich sind, um vorherzusagen, welche Auswirkungen eine bestimmte Mutation haben wird. Tatsächlich sind die Ergebnisse gerichteter Evolutionsexperimente überraschend, da die gewünschten Veränderungen häufig durch Mutationen verursacht werden, die einen solchen Effekt nicht haben sollten. Der Nachteil besteht darin, dass diese Methode einen hohen Durchsatz erfordert, der nicht für alle Proteine möglich ist. Eine große Menge rekombinanter DNA muss mutiert werden und die Produkte müssen auf die gewünschte Qualität überprüft werden. Aufgrund der Vielzahl an Optionen ist oft die Anschaffung von Robotern erforderlich, um den Prozess zu automatisieren. Darüber hinaus ist es nicht immer einfach, nach allen interessierenden Merkmalen zu suchen.

Kursarbeit

Disziplin: Agrarbiotechnologie

zum Thema: „Protein Engineering“

Einführung. Protein-Engineering

2 Protein-Engineering-Strategien. Beispiele für manipulierte Proteine. Anwendung des Protein-Engineerings

1 Bibliotheken von Peptiden und Epitopen

2 Reporterproteine in Fusionsproteinen

3 Einige Errungenschaften des Protein-Engineerings.

Abschluss

Referenzliste

Aufsatz

Forschung und Entwicklung: Protein-Engineering.

Schlüsselwörter: Biotechnologie, Gentechnik, Protein, genetischer Code, Gen, DNA, RNA, ATP, Peptide, Epitop.

Der Zweck der Studienarbeit: das Studium des Konzepts des „Protein Engineering“ und der Einsatzmöglichkeiten.

Mögliche Chancen des Protein-Engineerings:

Durch Veränderung der Bindungsstärke der umgewandelten Substanz – des Substrats – mit dem Enzym ist es möglich, die katalytische Gesamteffizienz der enzymatischen Reaktion zu steigern.

Durch die Erhöhung der Stabilität des Proteins in einem breiten Temperatur- und Säuregehaltsbereich des Mediums kann es unter Bedingungen verwendet werden, unter denen das ursprüngliche Protein denaturiert und seine Aktivität verliert.

Durch die Schaffung von Proteinen, die in wasserfreien Lösungsmitteln funktionieren, ist es möglich, katalytische Reaktionen unter unphysiologischen Bedingungen durchzuführen.

Durch die Veränderung des katalytischen Zentrums des Enzyms ist es möglich, seine Spezifität zu erhöhen und die Anzahl unerwünschter Nebenreaktionen zu reduzieren.

Durch die Erhöhung der Widerstandsfähigkeit des Proteins gegenüber Enzymen, die es abbauen, ist es möglich, das Verfahren zu seiner Reinigung zu vereinfachen.

Indem ein Protein so modifiziert wird, dass es ohne seine übliche Nicht-Aminosäurekomponente (Vitamin, Metallatom usw.) funktionieren kann, kann es in einigen kontinuierlichen technologischen Prozessen verwendet werden.

Durch die Veränderung der Struktur der regulatorischen Regionen des Enzyms ist es möglich, den Grad seiner Hemmung durch das Produkt der enzymatischen Reaktion in Form einer negativen Rückkopplung zu verringern und dadurch die Ausbeute des Produkts zu erhöhen.

Sie können ein Hybridprotein erstellen, das die Funktionen von zwei oder mehr Proteinen hat.

Es ist möglich, ein Fusionsprotein zu erzeugen, dessen Abschnitt den Austritt des Fusionsproteins aus der kultivierten Zelle oder dessen Extraktion aus der Mischung erleichtert.

Einführung

Seit jeher wird Biotechnologie vor allem in der Lebensmittel- und Leichtindustrie eingesetzt: bei der Weinherstellung, beim Backen, bei der Fermentation von Milchprodukten, bei der Verarbeitung von Flachs und Leder unter Einsatz von Mikroorganismen. In den letzten Jahrzehnten haben sich die Möglichkeiten der Biotechnologie enorm erweitert. Dies liegt daran, dass seine Methoden aus dem einfachen Grund rentabler sind als herkömmliche, weil in lebenden Organismen durch Enzyme katalysierte biochemische Reaktionen unter optimalen Bedingungen (Temperatur und Druck) ablaufen, produktiver und umweltfreundlicher sind und keine Chemikalien erfordern die die Umwelt vergiften.

Gegenstand der Biotechnologie sind zahlreiche Vertreter von Gruppen lebender Organismen – Mikroorganismen (Viren, Bakterien, Protozoen, Hefepilze), Pflanzen, Tiere sowie isolierte Zellen und subzelluläre Bestandteile (Organellen) und sogar Enzyme. Die Biotechnologie basiert auf den in lebenden Systemen ablaufenden physiologischen und biochemischen Prozessen, die zur Freisetzung von Energie, zur Synthese und zum Abbau von Stoffwechselprodukten sowie zur Bildung chemischer und struktureller Bestandteile der Zelle führen.

Die Hauptrichtung der Biotechnologie ist die Herstellung biologisch aktiver Verbindungen (Enzyme, Vitamine, Hormone), Arzneimittel (Antibiotika, Impfstoffe, Seren, hochspezifische Antikörper usw.) mit Hilfe von Mikroorganismen und kultivierten eukaryontischen Zellen sowie wertvollen Verbindungen (Futtermittelzusatzstoffe, z. B. essentielle Aminosäuren, Futterproteine usw.).

Gentechnische Methoden haben es ermöglicht, Hormone wie Insulin und Somatotropin (Wachstumshormon), die für die Behandlung genetisch bedingter Erkrankungen des Menschen notwendig sind, in industriellen Mengen zu synthetisieren.

Biotechnologie löst nicht nur spezifische Probleme der Wissenschaft und Produktion. Es hat eine globalere methodische Aufgabe – es erweitert und beschleunigt das Ausmaß des menschlichen Einflusses auf die Tierwelt und trägt zur Anpassung lebender Systeme an die Bedingungen der menschlichen Existenz, d. h. an die Noosphäre, bei. Die Biotechnologie fungiert somit als wichtiger Faktor der anthropogenen adaptiven Evolution.

Biotechnologie, Gen- und Zelltechnik haben vielversprechende Perspektiven. Mit dem Aufkommen immer neuer Vektoren wird der Mensch diese nutzen, um die notwendigen Gene in die Zellen von Pflanzen, Tieren und Menschen einzuführen. Dadurch werden nach und nach viele erbliche menschliche Krankheiten beseitigt, die Zellen werden gezwungen, die notwendigen Medikamente und biologisch aktiven Verbindungen zu synthetisieren und dann direkt die Proteine und essentiellen Aminosäuren, die gegessen werden. Mit Methoden, die die Natur bereits beherrscht, hoffen Biotechnologen, durch Photosynthese Wasserstoff zu gewinnen – den umweltfreundlichsten Brennstoff der Zukunft, Elektrizität, der unter normalen Bedingungen Luftstickstoff in Ammoniak umwandelt.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften natürlicher Proteine genügen oft nicht den Bedingungen, unter denen diese Proteine vom Menschen genutzt werden. Es ist eine Änderung seiner Primärstruktur erforderlich, die die Bildung eines Proteins mit einer anderen räumlichen Struktur als zuvor und neuen physikalisch-chemischen Eigenschaften gewährleistet, die es ermöglichen, die einem natürlichen Protein innewohnenden Funktionen unter anderen Bedingungen zu erfüllen. Protein Engineering beschäftigt sich mit dem Aufbau von Proteinen.

Ein weiterer Anwendungsbereich des Protein-Engineerings ist die Schaffung von Proteinen, die Stoffe und Mikroorganismen neutralisieren können, die für chemische und biologische Angriffe genutzt werden können. Beispielsweise können Hydrolase-Enzyme sowohl Nervengase als auch in der Landwirtschaft eingesetzte Pestizide neutralisieren. Gleichzeitig stellt die Herstellung, Lagerung und Verwendung von Enzymen keine Gefahr für die Umwelt und die menschliche Gesundheit dar.

Um ein modifiziertes Protein zu erhalten, werden Methoden der kombinatorischen Chemie eingesetzt und eine gerichtete Mutagenese durchgeführt – die Einführung spezifischer Veränderungen in den kodierenden DNA-Sequenzen, die zu bestimmten Veränderungen in den Aminosäuresequenzen führen. Um ein Protein mit den gewünschten Eigenschaften effektiv zu entwerfen, ist es notwendig, die Bildungsmuster der räumlichen Struktur des Proteins zu kennen, von denen seine physikalisch-chemischen Eigenschaften und Funktionen abhängen, das heißt, es ist notwendig zu wissen, wie die Primärstruktur des Proteins aussieht Jeder seiner Aminosäurereste beeinflusst die Eigenschaften und Funktionen des Proteins. Leider ist bei den meisten Proteinen die Tertiärstruktur unbekannt und es ist nicht immer bekannt, welche Aminosäure oder Aminosäuresequenz geändert werden muss, um ein Protein mit den gewünschten Eigenschaften zu erhalten. Mithilfe von Computeranalysen können Wissenschaftler bereits jetzt die Eigenschaften vieler Proteine anhand der Sequenz ihrer Aminosäurereste vorhersagen. Eine solche Analyse wird das Verfahren zur Herstellung der gewünschten Proteine erheblich vereinfachen. Um ein verändertes Protein mit den gewünschten Eigenschaften zu erhalten, gehen sie inzwischen grundsätzlich einen anderen Weg: Sie besorgen sich mehrere mutierte Gene und finden von einem davon das Proteinprodukt, das die gewünschten Eigenschaften hat.

Für die ortsgerichtete Mutagenese werden unterschiedliche experimentelle Ansätze verwendet. Nachdem ein verändertes Gen erhalten wurde, wird es in ein genetisches Konstrukt eingefügt und in prokaryotische oder eukaryotische Zellen eingeführt, die das von diesem genetischen Konstrukt kodierte Protein synthetisieren.

I. Protein-Engineering

.1 Das Konzept des Protein-Engineerings. Entwicklungsgeschichte

Die erste kontrollierte Modifikation eines Proteins wurde Mitte der 1960er Jahre von Koshland und Bender durchgeführt. Um die Hydroxylgruppe durch eine Sulfhydrylgruppe im aktiven Zentrum der Protease – Subtilisin – zu ersetzen, verwendeten sie die Methode der chemischen Modifikation. Es stellte sich jedoch heraus, dass ein solches Thiolsubtilisin die Proteaseaktivität nicht beibehält.

Abbildung 1. Funktionsschema des Protein-Engineerings

1.2 Protein-Engineering-Strategien

II. Beispiele für manipulierte Proteine

Protein-Engineering kann auf der chemischen Modifikation eines fertigen Proteins basieren oder auf gentechnischen Methoden, die die Herstellung modifizierter Varianten natürlicher Proteine ermöglichen.

Das Design eines bestimmten biologischen Katalysators erfolgt unter Berücksichtigung sowohl der Spezifität des Proteins als auch der katalytischen Aktivität des metallorganischen Komplexes. Hier sind Beispiele für solche Modifikationen, die durchgeführt wurden, um „halbsynthetische bioorganische Komplexe“ zu erhalten. Pottwal-Myoglobin ist in der Lage, Sauerstoff zu binden, besitzt jedoch keine biokatalytische Aktivität. Durch die Kombination dieses Biomoleküls mit drei rutheniumhaltigen Elektronentransferkomplexen, die an Histidinreste auf der Oberfläche von Proteinmolekülen binden, entsteht ein Komplex, der in der Lage ist, Sauerstoff zu reduzieren und gleichzeitig eine Reihe organischer Substrate wie Ascorbat zu oxidieren Rate fast gleich wie bei natürlicher Ascorbatoxidase. Prinzipiell können Proteine auch auf andere Weise verändert werden. Denken Sie zum Beispiel an Papain. Es ist eines der gut untersuchten proteolytischen Enzyme, für die eine dreidimensionale Struktur bestimmt wurde. In der Nähe des Cystein-25-Restes befindet sich auf der Oberfläche des Proteinmoleküls eine verlängerte Furche, in der die Proteolysereaktion abläuft. Diese Stelle kann mit einem Flavinderivat alkyliert werden, ohne die Zugänglichkeit der potenziellen Substratbindungsstelle zu verändern. Solche modifizierten Flavopaine wurden zur Oxidation von M-Alkyl-1,4-dihydronicotinamiden verwendet, und die katalytische Aktivität einiger dieser modifizierten Proteine war deutlich höher als die natürlicher Flavoprotein-NADH-Dehydrogenasen. Dadurch war es möglich, ein sehr wirksames halbsynthetisches Enzym herzustellen. Die Verwendung von Flavinen mit hochaktiven elektronenziehenden Substituenten an einer bestimmten Position könnte die Entwicklung wirksamer Katalysatoren für die Reduktion von Nikotinamid ermöglichen.

Die großen jüngsten Fortschritte in der chemischen Synthese von DNA haben grundlegend neue Möglichkeiten für das Protein-Engineering eröffnet: die Konstruktion einzigartiger Proteine, die in der Natur nicht vorkommen. Dies erfordert eine Weiterentwicklung der Technologie, damit die Veränderung von Genen durch gentechnische Methoden zu vorhersehbaren Veränderungen in Proteinen und zu einer Verbesserung ihrer genau definierten funktionellen Eigenschaften führt: Anzahl der Umdrehungen, KM für ein bestimmtes Substrat, thermische Stabilität, Temperaturoptimum, Stabilität und Aktivität in nichtwässrigen Lösungsmitteln, Substrat- und Reaktionsspezifität, Cofaktorbedarf, pH-Optimum, Proteaseresistenz, allosterische Regulation, Molekulargewicht und Struktur der Untereinheiten. Typischerweise wurde diese Verbesserung durch Mutagenese und Selektion und neuerdings auch durch chemische Modifikation und Immobilisierung erreicht. Um einen bestimmten Proteinmolekültyp erfolgreich zu entwerfen, ist es notwendig, eine Reihe grundlegender Muster zu identifizieren, die die Strukturmerkmale von Proteinen und ihre gewünschten Eigenschaften verbinden. Wenn man also die genaue Kristallstruktur eines untersuchten Proteinmoleküls kennt, ist es möglich, diejenigen Teile davon zu identifizieren, die gezielt modifiziert werden sollten, um seine katalytische Aktivität zu erhöhen. Eine solche Modifikation kann darin bestehen, die Aminosäuresequenz des Proteins zu ändern.

Ein weiteres Beispiel ist die Implementierung ortsspezifischer Mutagenese. Es geschieht auf folgende Weise. Das Gen des für den Forscher interessanten Proteins wird geklont und in einen geeigneten genetischen Träger eingefügt. Anschließend wird ein Oligonukleotidprimer mit der gewünschten Mutation synthetisiert, dessen zehn bis fünfzehn Nukleotidsequenzen hinreichend homolog zu einer bestimmten Region des natürlichen Gens sind und daher in der Lage sind, mit diesem eine Hybridstruktur zu bilden. Dieser synthetische Primer wird von Polymerasen verwendet, um die Synthese einer komplementären Kopie des Vektors zu initiieren, die dann vom Original getrennt und für die kontrollierte Synthese des mutierten Proteins verwendet wird. Ein alternativer Ansatz basiert auf der Kettenspaltung, der Entfernung der zu verändernden Stelle und deren Ersatz durch ein synthetisches Analogon mit der gewünschten Nukleotidsequenz.

Tyrosyl-tRNA-Synthetase katalysiert die Aminoacylierungsreaktion von Tyrosin-tRNA, die die Aktivierung von Tyrosin durch ATP zur Bildung von Tyrosyladenylat beinhaltet. Das aus Bacillus stearothermophilus isolierte Gen für dieses Enzym wurde in den Bakteriophagen M13 eingefügt. Anschließend wurden die katalytischen Eigenschaften des Enzyms, insbesondere seine Fähigkeit, das Substrat zu binden, durch ortsspezifische Modifikation verändert. Daher wurde Threonin-51 durch Alanin ersetzt. Dies führte zu einer Verdoppelung der Bindung des Substrats, offenbar aufgrund der Unmöglichkeit, eine Wasserstoffbrücke zwischen diesem Rest und Tyrosyladenylat zu bilden. Wenn Alanin durch Prolin ersetzt wird, wird die Konfiguration des Enzymmoleküls gestört, aber die Fähigkeit, das Substrat zu binden, erhöht sich um das Hundertfache, da seine Wechselwirkung mit Histidin-48 erleichtert wird. Ähnliche ortsspezifische Veränderungen wurden bei p-Lactamase beobachtet und gehen normalerweise mit einer Inaktivierung des Enzyms einher. Der Ersatz von Serin-70 durch Cystein führt zur Bildung von p-Thiolactamase, deren Bindungskonstante sich nicht von der des natürlichen Enzyms unterscheidet, deren Aktivität gegenüber Penicillin jedoch nur 1-2 % beträgt. Dennoch ist die Aktivität dieses mutierten Enzyms gegen einige aktivierte Cephalosporine nicht geringer als die anfängliche Aktivität oder übertrifft diese sogar; Diese Proteine sind auch resistenter gegen die Wirkung von Proteasen.

Durch ortsspezifische Einwirkung verursachte Mutationen werden heute verwendet, um die Angemessenheit der Ergebnisse von Strukturstudien zu testen. In einigen Fällen wurden sie verwendet, um zu zeigen, dass die strukturelle Stabilität eines Proteins und seine katalytische Aktivität entkoppelt werden können. Mit ausreichenden Informationen über die Beziehung zwischen Stabilität und Funktion der Proteinstruktur können wir möglicherweise die Aktivität biologischer Katalysatoren feinabstimmen und vollständig synthetische Analoga herstellen. In einer kürzlich erschienenen Arbeit wurde über die Klonierung des ersten synthetischen Enzymgens berichtet, das für das aktive Fragment des Ribonukleasemoleküls kodiert.

III. Anwendung des Protein-Engineerings

Protein-Engineering-Technologie wird (häufig in Kombination mit der Methode der rekombinanten DNA) eingesetzt, um die Eigenschaften bestehender Proteine (Enzyme, Antikörper, Zellrezeptoren) zu verbessern und neue Proteine zu schaffen, die in der Natur nicht vorkommen. Solche Proteine werden zur Herstellung von Medikamenten, zur Lebensmittelverarbeitung und zur industriellen Produktion verwendet.

Allerdings machen einige Eigenschaften von Biokatalysatoren ihren Einsatz in manchen Fällen unakzeptabel. Beispielsweise werden die meisten Enzyme abgebaut, wenn die Temperatur steigt. Wissenschaftler versuchen, solche Hindernisse zu überwinden und die Stabilität von Enzymen unter rauen Herstellungsbedingungen mithilfe von Protein-Engineering-Techniken zu erhöhen.

Neben industriellen Anwendungen hat das Protein-Engineering auch in der medizinischen Entwicklung seinen rechtmäßigen Platz gefunden. Forscher synthetisieren Proteine, die sich an Viren und mutierte tumorverursachende Gene binden und diese unschädlich machen können; entwickeln hochwirksame Impfstoffe und untersuchen Zelloberflächenrezeptorproteine, die oft Angriffspunkte für Arzneimittel sind. Wissenschaftler im Bereich Lebensmittelverbesserung nutzen Protein-Engineering, um die Eigenschaften von Proteinen zu verbessern, die pflanzliche Lebensmittel konservieren, sowie von Geliermitteln oder Verdickungsmitteln.

3.1 Bibliotheken von Peptiden und Epitopen

In einem lebenden Organismus werden die meisten biologischen Prozesse durch spezifische Protein-Protein- oder Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen gesteuert. Zu solchen Prozessen gehören beispielsweise die Regulation der Gentranskription unter dem Einfluss verschiedener Proteinfaktoren, die Interaktion von Proteinliganden mit Rezeptoren auf der Zelloberfläche und die spezifische Bindung von Antigenen durch die entsprechenden Antikörper. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der Wechselwirkung von Proteinliganden mit Rezeptoren ist von großer grundlegender und angewandter Bedeutung. Insbesondere die Entwicklung neuer Arzneimittel mit Proteincharakter beginnt in der Regel mit der Identifizierung der anfänglichen Aminosäuresequenz, die die gewünschte biologische Aktivität aufweist (die sogenannte „Haupt“-(Leit-)Sequenz). Allerdings können Peptide mit einer basischen Aminosäuresequenz auch unerwünschte biologische Eigenschaften haben: geringe Aktivität, Toxizität, geringe Stabilität im Körper usw.

Vor dem Aufkommen von Peptidbibliotheken erfolgte die Verbesserung ihrer biologischen Eigenschaften durch die sequentielle Synthese einer großen Anzahl von Analoga und das Testen ihrer biologischen Aktivität, was viel Zeit und Geld erforderte. In den letzten Jahren ist es möglich geworden, mithilfe automatischer Synthesizer in kurzer Zeit Tausende verschiedener Peptide herzustellen. Die entwickelten Methoden der ortsspezifischen Mutagenese ermöglichten es auch, die Anzahl der gleichzeitig gewonnenen und nacheinander auf biologische Aktivität getesteten Proteine dramatisch zu erhöhen. Allerdings haben erst kürzlich entwickelte Ansätze zur Erstellung von Peptidbibliotheken zur Produktion von Millionen von Aminosäuresequenzen geführt, die für ein effektives Screening erforderlich sind, um unter ihnen die Peptide zu identifizieren, die die Kriterien am besten erfüllen. Solche Bibliotheken werden verwendet, um die Wechselwirkung von Antikörpern mit Antigenen zu untersuchen, um neue Enzyminhibitoren und antimikrobielle Wirkstoffe zu entwickeln, um Moleküle mit der gewünschten biologischen Aktivität zu entwerfen oder um Proteinen, beispielsweise Antikörpern, neue Eigenschaften zu verleihen.

Peptidbibliotheken werden je nach Gewinnungsmethode in drei Gruppen eingeteilt. Zur ersten Gruppe gehören Bibliotheken, die durch chemische Synthese von Peptiden gewonnen werden, bei denen einzelne Peptide auf Mikroträgern immobilisiert werden. Bei diesem Ansatz werden nach der Zugabe der nächsten Aminosäuren in einzelnen Reaktionsmischungen zu den auf Mikroträgern immobilisierten Peptiden die Inhalte aller Reaktionsmischungen kombiniert und in neue Portionen aufgeteilt, die in der nächsten Stufe der Zugabe neuer Aminosäurereste verwendet werden. Nach einer Reihe solcher Schritte werden Peptide synthetisiert, die die bei der Synthese verwendeten Aminosäuresequenzen in allen möglichen zufälligen Kombinationen enthalten.

Auf Mikroträgern immobilisierte Peptidbibliotheken haben einen erheblichen Nachteil: Sie erfordern für das Screening die Verwendung gereinigter Rezeptoren in löslicher Form. Gleichzeitig werden in den meisten Fällen in biologischen Tests, die für die Grundlagenforschung und die pharmakologische Forschung durchgeführt werden, am häufigsten membranassoziierte Rezeptoren verwendet. Gemäß der zweiten Methode werden Peptidbibliotheken mithilfe der Festphasen-Peptidsynthese erhalten, bei der in jeder Phase der chemischen Addition der nächsten Aminosäure an wachsende Peptidketten äquimolare Mischungen aller oder einiger Vorläuferaminosäuren verwendet werden. Im letzten Schritt der Synthese werden die Peptide vom Träger getrennt, d. sie in eine lösliche Form umwandeln. Der dritte Ansatz zum Aufbau von Peptidbibliotheken, den wir nun beschreiben werden, ist gerade durch die Entwicklung gentechnischer Methoden real geworden. Es verdeutlicht perfekt die Möglichkeiten solcher Methoden und stellt zweifellos eine große Errungenschaft bei ihrer Anwendung dar. Lassen Sie uns in diesem Zusammenhang die Ergebnisse der Verwendung von Peptidbibliotheken bei der Untersuchung von Epitopen (antigenen Determinanten) von Proteinen genauer betrachten.

Die gentechnische Technologie zur Gewinnung von Hybridproteinen hat es ermöglicht, eine wirksame Methode zur Herstellung kurzer Peptide zur Analyse ihrer biologischen Aktivität zu entwickeln. Wie Genbibliotheken stellen gentechnisch veränderte Peptidbibliotheken einen großen (oft umfassenden) Satz kurzer Peptide dar. Zwei aktuelle Beobachtungen ermöglichen es, eine Peptidbibliothek gleichzeitig als eine Bibliothek von Proteinepitopen zu betrachten. Erstens können kurze Peptide alle wichtigen Aminosäurereste umfassen, die eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit Antikörpern spielen, und sie sind in der Lage, die großen antigenen Determinanten von Proteinen nachzuahmen. Zweitens tragen in den meisten Fällen nichtkovalente Bindungen, die zwischen den wenigen wichtigsten Aminosäureresten von Proteinliganden und ihren Rezeptoren gebildet werden, wesentlich zur Gesamtenergie der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung bei. Vor diesem Hintergrund kann jedes Peptid als potenzieller Ligand, Hapten oder Teil der antigenen Determinante größerer Polypeptide betrachtet werden, und jede Peptidbibliothek kann als Bibliothek von Proteinepitopen oder potenziellen Liganden für die entsprechenden Proteinrezeptoren betrachtet werden.

Die durch die Umsetzung des dritten Ansatzes in seiner modernen Form erhaltene Peptidbibliothek besteht aus einem Satz von Dutzenden oder sogar Hunderten Millionen kurzer, unterschiedlicher Aminosäuresequenzen, die als Teil ihrer eigenen auf der Oberfläche von Bakteriophagen-Virionen exprimiert werden Strukturproteine. Möglich wird dies durch die gentechnische Einführung hybrider rekombinanter Gene, die veränderte Strukturproteine seiner Virionen kodieren, in das Genom des Bakteriophagen. (Diese Methode wird als Phagendisplay bezeichnet.) Durch die Expression solcher Gene entstehen Hybridproteine, an deren N- oder C-Terminus sich zusätzliche Aminosäuresequenzen befinden.

Bibliotheken von Peptiden und Epitopen werden auch bei Studien zu den Mechanismen der humoralen Immunantwort sowie bei Erkrankungen des Immunsystems Anwendung finden. Insbesondere gehen die meisten Autoimmunerkrankungen mit der Bildung von Autoantikörpern gegen körpereigene Antigene einher. Diese Antikörper dienen in vielen Fällen als spezifische Marker für eine bestimmte Autoimmunerkrankung. Mithilfe einer Epitop-Bibliothek ist es prinzipiell möglich, Peptidmarker zu gewinnen, mit denen es möglich wäre, die Spezifität von Autoantikörpern während der Entwicklung eines pathologischen Prozesses sowohl in einem einzelnen Organismus als auch in einer Gruppe von Patienten zu überwachen und darüber hinaus zur Bestimmung der Spezifität von Autoantikörpern bei Erkrankungen unbekannter Ätiologie.

Bibliotheken von Peptiden und Epitopen können möglicherweise auch zum Screening von Immunseren verwendet werden, um Peptide zu identifizieren, die spezifisch mit schützenden Antikörpern interagieren. Solche Peptide ahmen die antigenen Determinanten pathogener Organismen nach und dienen als Angriffspunkte für die schützenden Antikörper des Körpers. Dies ermöglicht den Einsatz solcher Peptide zur Impfung von Patienten, denen Antikörper gegen die jeweiligen Erreger fehlen. Die Untersuchung von Epitopen mithilfe von Peptidbibliotheken ist ein Sonderfall eines der zahlreichen Anwendungsgebiete ihrer Verwendung in angewandten und grundlegenden Studien der Wechselwirkung von Liganden und Rezeptoren. Eine weitere Verbesserung dieses Ansatzes sollte zur Entwicklung neuer Arzneimittel auf Basis kurzer Peptide beitragen und für grundlegende Untersuchungen der Mechanismen von Protein-Protein-Wechselwirkungen nützlich sein.

3.2 Reporterproteine in Fusionsproteinen

In einem anderen Fall werden Fusionsproteine verwendet, um durch die Stabilisierung dieser Peptide innerhalb der Fusionsproteine eine hohe Expression kurzer Peptide in Bakterienzellen zu erreichen. Fusionsproteine werden häufig zur Identifizierung und Reinigung schwer nachweisbarer rekombinanter Proteine verwendet. Durch Anbringen von Galactosidase als Reporterprotein an den C-Terminus des untersuchten Proteins ist es beispielsweise möglich, das rekombinante Protein durch die Aktivität von Galactosidase zu reinigen und seine antigenen Determinanten durch immunchemische Methoden zu bestimmen. Durch die Verknüpfung von DNA-Fragmenten, die offene Leserahmen (ORFs) enthalten, mit Reporterproteingenen ist es möglich, solche Fusionsproteine auf Reporterproteinaktivität zu reinigen und sie zur Immunisierung von Labortieren zu verwenden. Die resultierenden Antikörper werden dann zur Reinigung des nativen Proteins, zu dem das vom ORF kodierte rekombinante Polypeptid gehört, und zur Identifizierung des klonierten Genfragments verwendet.

Mit Hilfe von Hybridproteinen wird auch das umgekehrte Problem der Klonierung eines unbekannten Gens gelöst, gegen dessen Proteinprodukt Antikörper vorhanden sind. In diesem Fall wird eine Klonbibliothek von Nukleotidsequenzen, die ORFs unbekannter Gene darstellen, in Vektoren erstellt, die es ermöglichen, den klonierten ORF im gleichen Leserahmen wie das Reportergen zu verknüpfen. Die aus der Expression dieser rekombinanten Gene resultierenden Hybridproteine werden mithilfe von Antikörpern durch Enzymimmunoassay-Methoden identifiziert. Hybridgene, die sekretierte Proteine und Reporterproteine kombinieren, bieten die Möglichkeit, die Mechanismen der Sekretion sowie die Lokalisierung und Bewegung sekretierter Proteine in Geweben auf neue Weise zu erforschen.

3.3 Einige Fortschritte im Protein-Engineering

Durch den Ersatz mehrerer Aminosäurereste des Lysozyms des Bakteriophagen T4 durch Cystein wurde ein Enzym mit einer großen Anzahl von Disulfidbindungen erhalten, wodurch dieses Enzym seine Aktivität bei einer höheren Temperatur beibehielt.

Der Ersatz eines Cysteinrests durch einen Serinrest im von Escherichia coli synthetisierten menschlichen p-Interferonmolekül verhinderte die Bildung intermolekularer Komplexe, bei denen die antivirale Aktivität dieses Arzneimittels um etwa das Zehnfache abnahm.

Der Ersatz eines Threoninrests durch einen Prolinrest im Tyrosyl-tRNA-Synthetase-Enzymmolekül erhöhte die katalytische Aktivität dieses Enzyms um das Zehnfache: Es begann, Tyrosin schnell an tRNA zu binden, das diese Aminosäure während der Translation auf das Ribosom überträgt.

Subtilisine sind serinreiche Enzyme, die Proteine abbauen. Sie werden von vielen Bakterien abgesondert und vom Menschen häufig zum biologischen Abbau genutzt. Sie binden stark Calciumatome, was ihre Stabilität erhöht. Allerdings gibt es in industriellen Prozessen chemische Verbindungen, die Kalzium binden, woraufhin Subtilisine ihre Aktivität verlieren. Durch die Veränderung des Gens entfernten die Wissenschaftler die an der Kalziumbindung beteiligten Aminosäuren aus dem Enzym und ersetzten eine Aminosäure durch eine andere, um die Stabilität von Subtilisin zu erhöhen. Das modifizierte Enzym erwies sich unter industrienahen Bedingungen als stabil und funktionell aktiv.

Es wurde gezeigt, dass es möglich ist, ein Enzym zu schaffen, das wie Restriktionsenzyme funktioniert, die DNA an genau definierten Stellen spalten. Wissenschaftler haben ein Hybridprotein geschaffen, dessen eines Fragment eine bestimmte Sequenz von Nukleotidresten im DNA-Molekül erkennt und das andere Fragment die DNA in diesem Bereich spaltet.

Gewebeplasminogenaktivator ist ein Enzym, das klinisch zur Auflösung von Blutgerinnseln eingesetzt wird. Leider wird es schnell aus dem Kreislaufsystem ausgeschieden und muss wiederholt oder in großen Dosen verabreicht werden, was zu Nebenwirkungen führt. Durch die Einführung von drei gerichteten Mutationen im Gen dieses Enzyms wurde ein langlebiges Enzym mit einer erhöhten Affinität zu abbaubarem Fibrin und der gleichen fibrinolytischen Aktivität wie das ursprüngliche Enzym erhalten.

Durch den Ersatz einer Aminosäure im Insulinmolekül stellten die Wissenschaftler sicher, dass bei der subkutanen Verabreichung dieses Hormons an Diabetiker die Konzentrationsänderung dieses Hormons im Blut der physiologischen Konzentration nach dem Essen nahe kam.

Es gibt drei Klassen von Interferonen mit antiviraler und krebshemmender Wirkung, die jedoch unterschiedliche Spezifitäten aufweisen. Es war verlockend, ein Hybrid-Interferon mit den Eigenschaften von drei Arten von Interferonen zu entwickeln. Es wurden Hybridgene geschaffen, die Fragmente verschiedener Arten natürlicher Interferon-Gene enthalten. Einige dieser Gene sorgten durch die Integration in Bakterienzellen für die Synthese von Hybrid-Interferonen mit größerer Antikrebsaktivität als die der Ausgangsmoleküle.

Natürliches menschliches Wachstumshormon bindet nicht nur an den Rezeptor dieses Hormons, sondern auch an den Rezeptor eines anderen Hormons – Prolaktin. Um unerwünschte Nebenwirkungen während der Behandlung zu vermeiden, beschlossen die Wissenschaftler, die Möglichkeit der Bindung von Wachstumshormon an den Prolaktinrezeptor auszuschließen. Dies erreichten sie, indem sie einige der Aminosäuren in der Primärstruktur des Wachstumshormons durch Gentechnik ersetzten.

Bei der Entwicklung von Arzneimitteln gegen HIV-Infektionen erhielten Wissenschaftler ein Hybridprotein, von dem ein Fragment die spezifische Bindung dieses Proteins nur an virusbefallene Lymphozyten ermöglichte, ein anderes Fragment das Hybridprotein in die betroffene Zelle eindrang und ein anderes Fragment die Proteinsynthese in der betroffenen Zelle störte Zelle, was zu ihrem Tod führte.

Proteine sind das Hauptziel für Medikamente. Mittlerweile sind etwa 500 Angriffspunkte für Medikamente bekannt. In den kommenden Jahren wird ihre Zahl auf 10.000 steigen, was die Entwicklung neuer, wirksamerer und sicherer Medikamente ermöglichen wird. In jüngster Zeit wurden grundlegend neue Ansätze für die Suche nach Medikamenten entwickelt: Nicht einzelne Proteine, sondern deren Komplexe, Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinfaltungen gelten als Angriffspunkte.

Abschluss

Derzeit besteht die beliebteste Anwendung des Protein-Engineerings darin, die katalytischen Eigenschaften von Enzymen zu verändern, um „umweltfreundliche“ industrielle Prozesse zu entwickeln. Aus ökologischer Sicht sind Enzyme von allen in der Industrie eingesetzten Katalysatoren die akzeptabelsten. Dies wird durch die Fähigkeit von Biokatalysatoren gewährleistet, sich in Wasser aufzulösen und in einer Umgebung mit neutralem pH-Wert und bei relativ niedrigen Temperaturen voll zu funktionieren. Darüber hinaus entstehen beim Einsatz von Biokatalysatoren aufgrund ihrer hohen Spezifität nur sehr wenige unerwünschte Nebenprodukte bei der Produktion. Umweltfreundliche und energiesparende Industrieprozesse mit Biokatalysatoren werden seit langem aktiv in den Bereichen Chemie, Textil, Pharma, Zellstoff und Papier, Lebensmittel, Energie und anderen Bereichen der modernen Industrie eingeführt.

Protein-Engineering-Mutagenese modifiziert

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Methoden der Gentechnik, insbesondere das Klonen einzelner Gene oder ihrer Teile sowie die DNA-Sequenzierung, haben es ermöglicht, die Methodik der Mutagenese deutlich zu verbessern und die Hauptnachteile klassischer Methoden zur Induktion von Mutationen in Genomen zu beseitigen. Die klassische genetische Analyse geht von der Wirkung eines mutagenen Faktors in vivo auf das gesamte Genom aus, wodurch darin zufällige, oft mehrfache Mutationen auftreten, was die Identifizierung von Mutanten erheblich erschwert. Die Identifizierung von Mutanten erfolgt anhand veränderter phänotypischer Merkmale, und die Art der Mutation kann nach der DNA-Sequenzierung bestimmt werden. Die moderne lokalisierte Mutagenese beinhaltet tatsächlich die umgekehrten Vorgänge: Zuerst wird das Gen oder sein interessierender Abschnitt geklont, seine Struktur wird während der Sequenzierung bestimmt und dann werden in vitro die erforderlichen Änderungen in seiner Zusammensetzung vorgenommen. Die Folgen der induzierten Mutation werden nach der Einführung des mutierten Gens in den ursprünglichen Organismus bestimmt.

Die einfachste Variante der lokalisierten Mutagenese besteht in der Behandlung eines geklonten DNA-Fragments mit einem der mutagenen Faktoren, allerdings führt eine solche Exposition auch zu zufälligen Veränderungen in der Struktur des Fragments. Zuverlässigere und häufiger verwendete Methoden der lokalisierten Mutagenese werden ohne den Einsatz mutagener Faktoren durchgeführt. Unter den Mutationsarten überwiegen Deletionen, Insertionen und Nukleotidsubstitutionen.

Löschungen. Diese Arten von Mutationen werden durch Endonukleasen durch lokalisierte Mutagenese erzeugt. Es werden sowohl restriktive als auch unspezifische Endonukleasen verwendet. Die einfachste Anwendung von Restriktionsenzymen besteht darin, ein Genom mit einem Restriktionsenzym zu spalten, das mehrere Brüche unter Bildung von klebrigen Enden einführt. Die resultierenden Fragmente werden mit DNA-Ligase wieder zu einem Ring geschlossen, was zur Bildung von Molekülen führen kann, die keinen der DNA-Abschnitte enthalten. Dieser Ansatz führt zu großen Deletionen und wird im Allgemeinen in Vorversuchen verwendet, um die Funktionen relativ großer Abschnitte geklonter DNA zu bestimmen.

Kleine Löschungen werden wie folgt erhalten. Das klonierte Fragment wird im Vektor an der entsprechenden Stelle mit einem Restriktionsenzym verdaut (Abb. 21.1). Das resultierende lineare Molekül wird mit Exonuklease III behandelt, die einen Strang in der DNA hydrolysiert.

beginnend am 3'-Ende. Das Ergebnis ist eine Reihe von Molekülen mit einzelsträngigen 5'-Schwänzen unterschiedlicher Länge. Diese Schwänze werden durch einzelsträngige DNA-spezifische S1-Nuklease hydrolysiert und es bilden sich Deletionen in der DNA. Es ist auch möglich, die Exonuklease Bal 31 zu verwenden, die den Abbau beider Stränge ausgehend von den Enden linearer DNA-Moleküle katalysiert. Der Verlauf nukleotischer Reaktionen wird durch Variation der Inkubationszeit, Temperatur und Enzymkonzentration reguliert, wodurch die Bildung von Deletionen unterschiedlicher Länge induziert wird. Die resultierenden linearen DNA-Deletionsvarianten werden vor der Zyklisierung häufig mit Linkern versehen, so dass Restriktionsstellen im Bereich der Deletion vorhanden sind. Es gibt weitere Modifikationen der beschriebenen Methoden.

Einsätze (Einsätze). Um Insertionen zu erhalten, wird die klonierte DNA mit einem Restriktionsenzym oder einer unspezifischen Endonuklease verdaut und dann werden die resultierenden Fragmente in Gegenwart des in die DNA einzufügenden Segments ligiert. Am häufigsten werden als solche Segmente chemisch synthetisierte Polylinker verwendet (Kapitel 20).

Insertionen können ebenso wie Deletionen die Integrität des Gens oder die Struktur seiner regulatorischen Regionen stören, was zur Synthese eines defekten Proteins (im Falle ausgedehnter Deletionen oder eines Frameshifts normalerweise inaktiv) oder zu Veränderungen im Transkriptionsprozess des Gens führt Gen von Interesse. Auf diese Weise werden häufig regulatorische Mutanten gewonnen und exprimierte Vektoren konstruiert (Kapitel 20).

Punktmutationen . Bei diesen Mutationen handelt es sich um Nukleotidsubstitutionen. Um sie zu erhalten, können verschiedene Ansätze verwendet werden: Cytosin-Desaminierung, Einschluss von Nukleotidanaloga, falscher Einschluss von Nukleotiden während der Lückenreparatur usw.

Die erste Methode basiert auf der Tatsache, dass Cytosinreste in einzelsträngiger DNA durch Behandlung mit Bisulfit-Ionen desaminiert werden können, um Uracil zu bilden. Einzelsträngige Regionen in der DNA werden normalerweise in der Nähe von Restriktionsstellen erhalten, beispielsweise durch die Wirkung von Exonuklease III. Nach der Behandlung mit Bisulfit werden die einzelsträngigen Lücken mit DNA-Polymerase gefüllt und die Enden ligiert. An Stellen, an denen während der Desaminierung Uridylat anstelle von Cytidylat gebildet wurde, nimmt Adenylat die komplementäre Position ein, und während der Replikation eines solchen Moleküls wird das GC-Paar durch das AT-Paar ersetzt.

Ein weiterer Ansatz zur Induktion von Substitutionen besteht darin, geklonte DNA mit einem Restriktionsenzym in Gegenwart von Ethidiumbromid zu behandeln, das zwischen Basenpaarebenen eingefügt wird und Störungen in der Duplexstruktur hervorruft. Dadurch entsteht nur ein Einzelstrang-DNA-Bruch. An der Stelle des Einzelstrangbruchs entsteht eine kleine Lücke, die dann in Gegenwart von DNA-Polymerase, dATP, dGTP, dCTP und N-4-Hydroxycytosintriphosphat anstelle von dTTP aufgebaut wird. Hydroxycytosintriphosphat ist anstelle von Thymidylat in der Kette enthalten, aber während der DNA-Replikation paart es sich gleichermaßen gut mit Adenylat und Guanylat. Durch den Einbau von Guanylat kommt es nach einer weiteren Replikationsrunde an dieser Stelle zur AT → GC-Substitution (Abb. 21.2). Denn bei dieser Methode erfolgt der Nukleotidersatz im Inneren

Durch die Verwendung der Restriktionsstelle ist es möglich, leicht zwischen Vektoren mit der Originalsequenz und mutierten Vektoren zu unterscheiden. Dazu reicht es aus, sie mit dem im Experiment verwendeten Restriktionsenzym zu behandeln: Die mutierten Moleküle werden nicht gespalten.

Eine ähnliche Methode basiert auf der Verwendung von nur drei der vier möglichen Nukleotide, wenn eine einzelsträngige Lücke mit DNA-Polymerase gefüllt wird. In den meisten Fällen stoppt das Enzym an der Stelle des Moleküls, an der es auf ein zum fehlenden Nukleotid komplementäres Nukleotid trifft. Allerdings macht die DNA-Polymerase gelegentlich einen Fehler und schließt eines der drei vorhandenen Nukleotide ein. Dies führt zur Bildung von Ringmolekülen, die ungepaarte, nichtkomplementäre stickstoffhaltige Basen enthalten. Wenn solche Vektoren in Bakterienzellen eingeführt werden, reparieren einige der Moleküle solche Schäden. Dadurch wird die ursprüngliche Sequenz nach der Replikation in der Hälfte der Moleküle wiederhergestellt und in der anderen Hälfte wird die Mutation fixiert. Mutierte Moleküle können mit der oben beschriebenen Methode unterschieden werden.

Ortsspezifische Mutagenese. Die charakterisierten Methoden der lokalisierten Mutagenese zeichnen sich dadurch aus, dass die Orte, an denen Mutationen auftreten, zufällig ausgewählt werden. Gleichzeitig ermöglicht die Technik der ortsspezifischen Mutagenese die Einführung von Mutationen in einer genau definierten Region eines Gens. Dies geschieht mithilfe synthetischer (durch chemische Synthese gewonnener) Oligonukleotide mit vorgegebener Sequenz. Das Verfahren ist insofern praktisch, als es nicht das Vorhandensein geeigneter Restriktionsstellen erfordert. Die Methode basiert auf der Bildung von Heteroduplexen zwischen einem synthetischen Oligonukleotid, das eine Mutation enthält, und komplementärer einzelsträngiger DNA im Vektor.

Gehen Sie wie folgt vor. Es wird ein kleines Oligonukleotid (8–20 Monomere) synthetisiert, das zu dem Teil des Gens komplementär ist, in dem eine Mutation erfolgen soll. Bei der Zusammensetzung des Oligonukleotids im zentralen Bereich sind eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen zulässig. Das untersuchte Gen oder sein Fragment wird in den Vektor auf Basis des M13-Phagen kloniert, um zirkuläre einzelsträngige rekombinante DNA zu erhalten. Mischen und Annealing rekombinanter Vektoren mit Oligonukleotiden. Das Oligonukleotid hybridisiert mit der komplementären Region, während nichtkomplementäre Nukleotide ungepaart bleiben. Das Oligonukleotid fungiert als Primer in der Polymerasereaktion, an der die DNA-Polymerase in vitro beteiligt ist. Der Ring wird mit Ligasen geschlossen. Das resultierende kreisförmige Molekül wird in E. coli-Zellen eingeführt, wo eine teilweise Reparatur mutierter Replikationsstellen erfolgt. Die Mutationsrate variiert normalerweise zwischen 1 und 50 %. Die Auswahl von Zellen, die mutierte DNA-Moleküle enthalten, kann auf verschiedene Arten erfolgen, wobei die Methode unter Verwendung eines radioaktiv markierten Oligonukleotids, das zur Mutagenese verwendet wird, den Vorteil hat. In diesem Fall dient dieses Nukleotid als Sonde. Das Prinzip der Verwendung einer solchen Sonde basiert auf der Tatsache, dass sie zur mutierten DNA vollständig und zur Wildtyp-DNA teilweise komplementär ist. Es ist möglich, solche Hybridisierungsbedingungen (vor allem die Temperatur) zu wählen, dass die Hybridisierung der markierten Sonde nur mit der mutierten DNA-Sequenz stabil ist, die durch Radioautographie nachgewiesen werden kann.

Die Methode der ortsspezifischen Mutagenese ist besonders wertvoll, da sie es ermöglicht, Mutationen zu isolieren, ohne ihre phänotypische Manifestation zu kontrollieren. Diese Methode eröffnet neue Möglichkeiten zur Untersuchung der Funktionen von Genregulationselementen, ermöglicht die Änderung der „Stärke“ von Promotoren, die Optimierung von Bindungsstellen mit Ribosomen usw. Eine der Hauptanwendungen dieser Methode ist Protein-Engineering.

Protein-Engineering. Dieser Begriff bezeichnet eine Reihe methodischer Techniken, die die Rekonstruktion eines Proteinmoleküls durch gezielte Einführung geeigneter Mutationen in einem Strukturgen (ortsspezifische Mutagenese) und damit der gewünschten Aminosäuresubstitutionen in der Primärstruktur des Proteins ermöglichen.

Ein anschauliches Beispiel für den Aufbau aktiverer Proteine sind die Experimente von Fersht und Mitarbeitern mit dem Enzym Tyrosyl-tRNA-Synthetase aus dem Bakterium Bacillus stearothermophilus. Eine Analyse der Folgen von Aminosäuresubstitutionen im aktiven Zentrum dieses Enzyms führte zu dem Schluss, dass die Entfernung von Gruppen, die schwache Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Substrat bilden, seine Affinität zum Substrat verbessern kann. Es wurde festgestellt, dass Threonin-51 (es nimmt die 51. Position im Peptid ein) eine lange und schwache Wasserstoffbrücke mit dem Sauerstoff des Riboserings eingeht, wenn Tyrosyladenylat gebunden wird. Gleichzeitig wurde festgestellt, dass Prolin in E. coli-Bakterien die gleiche Position einnimmt. Die ortsspezifische Mutagenese des Gens, das die Struktur der B.stearothermophilus-Tyrosyl-tRNA-Synthetase bestimmt, ermöglichte die Bereitstellung eines Ersatzes thr-51→pro-51 in einem Peptid. Dadurch verbesserte sich die Bindung von ATP im aktiven Zentrum des Enzyms dramatisch und seine katalytische Aktivität erhöhte sich um das 25-fache.

Ein weiteres ebenso bedeutendes Beispiel für die Proteinrekonstruktion von praktischer Bedeutung ist die von Estelle et al. durchgeführte Modifikation von Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens. Subtilisine sind Serinproteinasen, die von Bakterien in die Umwelt abgegeben werden. Diese Enzyme werden in großem Maßstab von der Biotechnologieindustrie hergestellt und finden häufig in Waschmittelformulierungen Verwendung. Der Nachteil von Subtilisinen ist ein starker Rückgang der proteolytischen Aktivität unter Einwirkung von Oxidationsmitteln, auch solchen, die in Waschpulvern enthalten sind. Die Aufgabe der Rekonstruktion des BPN-Subtilisinmoleküls bestand darin, es gegen chemische Oxidation zu stabilisieren.

In vorläufigen Experimenten wurde festgestellt, dass Subtilisin in Gegenwart von Wasserstoffperoxid seine Aktivität aufgrund der Oxidation des Methionin-222-Restes, der sich in das entsprechende Sulfoxid umwandelt, schnell verringert. Methoden der ortsspezifischen Mutagenese stellten den Ersatz dieses Methioninrests durch alle anderen 19 Proteinaminosäuren sicher. Plasmide mit mutierten Genen wurden in Stämme mit Deletionen in den entsprechenden Genen eingeführt und die Eigenschaften der produzierten Subtilisine analysiert. Mutanten mit Serin und Alanin erwiesen sich als ausreichend stabil gegenüber der Wirkung von Peroxid222. Der Mutant mit dem Cystein-222-Rest erwies sich als der aktivste; seine spezifische Aktivität übertraf die des Wildtyp-Stammes um 38 %.

Auf ähnliche Weise konnte die Aktivität von b-Interferon gesteigert werden. Zu den weiteren Errungenschaften des Protein-Engineerings zählen Studien zur Aufklärung der transformierenden Aktivität von Onkoproteinen; Veränderung der Thermostabilität von Enzymen, zum Beispiel zur Gewinnung von thermolabilem Renin und thermostabiler a-Amylase; eine Steigerung der Effizienz der Insulinbindung durch den entsprechenden Plasmamembranrezeptor aufgrund des Ersatzes von Histidin durch Aspartat an Position 10 der b-Kette des Hormons sowie viele andere Beispiele. Zahlreiche Protein-Engineering-Produkte haben bereits praktische Anwendung in Herstellungsprozessen gefunden.

Sicherheitsfragen für Kapitel 3

MAS-Auswahl (Marker-Assistent-Auswahl, Auswahl mithilfe von Markern).

Einführung von DNA in Pflanzenzellen mithilfe von Ti- und Ri-Plasmiden.

A. tumefaciens verursacht die Bildung von Tumoren im Stamm zweikeimblättriger Pflanzen – den sogenannten Wurzelhalsgallen. Bakterien heften sich an der Verletzungsstelle an Pflanzenzellen. Die Bindungsstellen auf der Bakterienoberfläche scheinen β-Glucan-Moleküle und die O-Antigenkette des Lipopolysaccharids der äußeren Membran zu sein.

Die Bakterien binden an höhere pflanzliche Rezeptoren, die aus Protein und Pektin bestehen; Lektine spielen in diesem Fall keine Rolle. Konstitutiv sind bakterielle Bindungsstellen und pflanzliche Rezeptoren; beide Partner haben sie bereits vor dem Moment der Interaktion. Der erste Schritt der Interaktion mit der Pflanze – die Erkennung – sollte als spezifische Pflanzenadhäsion betrachtet werden. Sobald sich die Bakterien an der Oberfläche pflanzlicher Zellen festgesetzt haben, beginnen sie, Zellulosefibrillen zu bilden. Unter dem Rasterelektronenmikroskop sind diese Fibrillen bereits 90 Minuten nach Zugabe der Bakterien zur Zellkultursuspension des Karottengewebes sichtbar. Nach 10-stündiger Inkubation bilden Fibrillen ein Netzwerk, das die Oberfläche der Pflanzenzellen bedeckt. Fibrillen dienen dazu, Bakterien fester auf der Oberfläche des Wirts zu verankern. Zellulosefibrillen können von frei schwebenden Bakterienzellen festgehalten werden. Durch die Fixierung an der Pflanzenoberfläche erhöhen Fibrillen die Infektionsvielfalt. Durch die Vermehrung bilden sich Bakterienansammlungen auf der Pflanzenoberfläche.

Durch die Freisetzung pektolytischer Enzyme durch Bakterien wird die Zellwand der Pflanze geschädigt, wodurch ein enger Kontakt zwischen Bakterien und dem Plasmalemma der Pflanzenzelle gewährleistet ist. Dieser Kontakt ist für die Übertragung der DNA von Bakterien auf die Pflanzenzelle notwendig. Der DNA-Transfer erfolgt ohne Verletzung der Integrität der Pflanzenzellmembran, erfordert jedoch deren bestimmten Zustand – Kompetenz.

Die Fähigkeit von A. tumefaciens, in Pflanzen Wurzelhalsgallentumoren zu induzieren, korreliert mit dem Vorhandensein des Ti-Plasmids in Pflanzen. Die Tumortransformation äußert sich in einer Hypertrophie, die nach dem Eindringen von Agrobakterien in die verletzten Bereiche (Stellen) von Pflanzen auftritt (Abb. 13). Transformation ist das Ergebnis eines stabilen kovalenten Einbaus (Insertion oder Integration) eines Segments („übertragene“ oder T-DNA) eines großen Plasmids (pTi – tumorinduzierend oder pRi – wurzelinduzierend) von Bakterien in die Kern-DNA einer Pflanzenzelle .

Abbildung 10. – Genetische Besiedlung der Pflanze A. tumefaciens: 1- Agrobakterien existieren in der Rhizosphäre; 2 – Struktur von A. tumefaciens; 3 – Integration von T-DNA in das Genom; 4 - Tumorbildung

Eine andere Art von Agrobakterien – A. rhizogenes – verursacht eine Krankheit namens „Bartwurzel“, bei der sich im Bereich der Wurzelschädigung eine Masse neuer Wurzeln bildet. A. rubi induziert normalerweise unorganisierte Tumoren (Teratome), Stämme von A. radiobacter sind avirulent.

Im Gegensatz zu den meisten Geweben aus normalen Pflanzen können transformierte Gewebe in In-vitro-Kulturen unter aseptischen (sterilen) Bedingungen ohne exogen zugesetzte Auxine und Zytokinine unbegrenzt wachsen. Darüber hinaus synthetisieren transformierte Gewebe häufig eine oder mehrere Gruppen von Verbindungen, sogenannte Opine, die normalerweise nicht in nicht transformierten Pflanzengeweben vorkommen. Tumoren – durch Agrobacterium tumefaciens induzierte Wurzelhalsgallen – wurden am ausführlichsten untersucht. Es handelt sich um wirklich bösartige Tumoren, die in einem Kulturmedium ohne Wachstumsstimulanzien wachsen können – Phytohormone, die für das Wachstum normaler Gewebe notwendig sind.

Tumore können in vitro über viele Jahre hinweg aufrechterhalten werden und sind bei Verwendung in der Lage, in gesunden Pflanzen Tumore zu induzieren. Unter natürlichen Bedingungen bilden sich Wurzelgallen an der Verbindung der Wurzel mit dem Stamm (am Wurzelhals), woher ihr Name von der Wurzelgalle stammt. Wurzelgallen können sich aber auch an den unterirdischen Pflanzenteilen, zum Beispiel an den Wurzeln von Obstbäumen, und an der oberirdischen, zum Beispiel an einem Weintraubenstiel, entwickeln.

Im Labor lassen sich diese Krankheiten experimentell an gesunden Pflanzen auslösen, indem man sie mit Bakterien infiziert. Pflanzen müssen vor der Inokulation verletzt werden, wobei Tumore an beschädigten Stellen der Pflanze auftreten, normalerweise am Stängel oder an den Blättern der Pflanze. Als Versuchsobjekte werden neben ganzen Pflanzen auch Explantate wie Karottenscheiben und Teile anderer Pflanzenorgane verwendet.

Kronengallengewebe enthalten höhere Mengen an Auxin und Zytokininen. Eine weitere erbliche Veränderung in den Zellen von Wurzelgallen wurde entdeckt – die Synthese von Opinen. Ein für Pflanzen ungewöhnliches Argininderivat, das nur in bestimmten Tumorlinien vorkommt, wurde Octopin genannt. Dann wurde gezeigt, dass andere Tumorlinien eine andere Verbindung synthetisieren – Nopalin, ebenfalls ein Derivat von Arginin. Abhängig von der Art des im Tumor induzierten Opins erhielten die Stämme von A. tumefaciens und die darin enthaltenen Ti-Plasmide die entsprechende Bezeichnung – Octopin oder Nopalin.

Agrobakterien, die Tumore induzieren, in denen weder Nopalin noch Octopin vorkommen, wurden bisher als Nulltyp-Stämme bezeichnet. Später wurde gezeigt, dass Opine der dritten Klasse, Agropine, in Tumoren vom Typ Null synthetisiert werden. Es wurden auch andere Arten von Meinungen gefunden. Da alle Opine nur in Tumorzellen vorkommen und in normalen Pflanzenzellen oder pflanzlichen Tumorzellen anderer Art fehlen, können Opine als spezifische biochemische Marker für Kronengallenzellen angesehen werden.

Tumore, die sich aus einer oder mehreren Zellen entwickeln, wachsen schnell zu großen Gebilden heran, deren Durchmesser bei bestimmten Baumarten einen Meter erreichen kann. Ein typischer unorganisierter Tumor ist eine mehr oder weniger runde, entdifferenzierte Zellmasse (Kallus), die glatt oder rau, parenchymal oder verholzt sein kann. Manchmal bilden sich an der Peripherie solcher Tumoren blattförmige Strukturen (Teratome), manchmal auch Adventivwurzeln. Bei infizierten Pflanzen werden häufig Sekundärtumoren beobachtet, die deutlich von den Primärtumoren entfernt sind. Sie befinden sich normalerweise oberhalb des Primärtumors, was auf eine Bewegung der Bakterien oder des transformierenden Agens in Richtung der Transpiration hindeutet.

Die Verteilung von Agrobacterium und anderen phytopathogenen Bakterien in den Interzellularräumen und im Xylem ist eine gut belegte Tatsache. Agrobakterien können sich mit beträchtlicher Geschwindigkeit über große Entfernungen bewegen. Offensichtlich ist dies nicht der einzige Grund für die Entstehung von Sekundärtumoren. Die Organisation von Tumoren, nämlich Form, Größe und Art der Entwicklung, wird durch drei Faktoren bestimmt:

Agrobacterium-Stamm,

Genotyp der Wirtspflanze,

Physiologischer Zustand infizierter Pflanzenzellen.

Agrobacterium hat ein sehr breites Wirtsspektrum und kann praktisch alle zweikeimblättrigen Pflanzen infizieren. Lange Zeit glaubte man, dass einkeimblättrige Pflanzen nicht anfällig für agrobakterielle Infektionen seien. Derzeit wurde gezeigt, dass Agrobakterien unter bestimmten Bedingungen einkeimblättrige Pflanzen infizieren können, insbesondere Vertreter von Familien wie Amaryllidaceae, Liliaceae, Gramineae, Iridaceae und einigen anderen. Es gibt jedoch einige Variationen im Wirtsbereich verschiedener Agrobacterium-Stämme: Einige Stämme können bei bestimmten Pflanzenarten Gallen auslösen, andere jedoch nicht infizieren. Verschiedene Sorten derselben Pflanze können auch unterschiedlich anfällig für einen bestimmten Bakterienstamm sein.

Die Unmöglichkeit einer Infektion in der Natur ist auf das Fehlen geeigneter Rezeptoren zurückzuführen, die für die Interaktion mit Bakterien erforderlich sind. Ein weiterer Faktor, der die Infektion einkeimblättriger Agrobakterien verhindert, kann das Fehlen von Agrobacterium-Virulenzinduktoren mit niedrigem Molekulargewicht in Pflanzenzellen sein, beispielsweise Acetosyringon, die normalerweise im Zellsaft vorhanden sind, wenn zweikeimblättrige Pflanzen verletzt werden.

Detaillierte Informationen über die Struktur von Agrobacterium-Plasmiden wurden durch deren Restriktion oder physikalische Kartierung gewonnen. Als Ergebnis der Forschung wurden vier Haupthomologiebereiche zwischen den Octopin- und Nopalin-Plasmiden gefunden. Zwei konservierte Regionen (Regionen A und D) sind an der Onkogenität beteiligt, eine weitere (B) entspricht der Plasmid-Replikationskontrollregion, während die letzte (C) konjugative Transferfunktionen kodiert (Abb. 14).

Somit verfügen Plasmide zusätzlich zur T-DNA über eine Region, die die Konjugationsfunktion kodiert (Tra), eine Replikationsregion (Ori V) und eine Virulenzregion (Vir). Ti-Plasmidsequenzen, die T-DNA flankieren (Grenz- oder Terminalregionen), spielen eine wichtige Rolle bei der Integration in das Pflanzengenom und enthalten unvollständige direkte Wiederholungen von 24–25 bp. Die Entfernung des linken Randes der T-DNA hat keinen Einfluss auf die Tumorbildung, die Entfernung des rechten Randbereichs führt jedoch zu einem fast vollständigen Verlust der Virulenz. Es hat sich gezeigt, dass die Deletion der richtigen Wiederholung oder eines Teils davon zum Verlust der Fähigkeit der T-DNA führt, in die Pflanzen-DNA eingebaut zu werden. Angesichts der wichtigen Rolle der Enden der T-Region bei der Übertragung von T-DNA kann davon ausgegangen werden, dass jedes zwischen diesen Enden eingefügte DNA-Segment als Teil der T-DNA auf Pflanzen übertragen werden kann. Plasmide werden so verändert, dass alle onkogenen Sequenzen entfernt werden, da sie weder an der Übertragung noch an der Integration in das Genom der Wirtszelle beteiligt sind. Anstelle dieser Gene kann fremde DNA eingefügt werden und das Plasmid verliert seine onkogenen Eigenschaften. In regenerativen Pflanzen vorhandene nicht-onkogene T-DNA wird nach den Gesetzen von Mendel übertragen. Es wurden zwei Methoden entwickelt, um Ti-Plasmidsequenzen, die das gewünschte Gen enthalten, in eine Pflanze einzuführen.

Abbildung 11. – Struktur von Ti-Plasmiden vom Nopalin- und Octopin-Typ

Die erste Methode – die Methode der „Zwischenvektoren“ (kointegrative Vektoren) – basiert auf der Verwendung des E. coli-Plasmids pBR 322 (Abb. 15). Die T-DNA wird mit Restriktionsenzymen aus dem Ti-Plasmid geschnitten und in das pBR 322-Plasmid zur Klonierung in E. coli eingefügt. Bakterien, die das T-DNA-Plasmid enthalten, werden vermehrt und das Plasmid isoliert. Anschließend wird das gewünschte Gen mithilfe von Restriktionsenzymen in die klonierte T-DNA eingefügt. Dieses rekombinante Molekül, das die T-DNA mit dem darin eingefügten Gen enthält, wird erneut in großer Zahl vermehrt, also in Escherichia coli kloniert. Anschließend werden sie mittels Konjugation in Agrobacterium-Zellen eingeschleust, die das vollständige Ti-Plasmid tragen.

Zwischen den T-Segmenten des nativen Ti-Plasmids und dem Zwischenvektor findet eine homologe Rekombination statt. Dadurch wird T-DNA mit einem inserierten Gen in das native Ti-Plasmid aufgenommen und ersetzt normale DNA. Es werden A. tumefaciens-Zellen gewonnen, die Ti-Plasmide mit den notwendigen Genen tragen, die in das T-Segment eingebaut sind. Darüber hinaus erfolgt ihr Transfer in Pflanzenzellen auf die für Agrobakterien übliche Weise.

Abbildung 12. – Erstellung eines kointegrativen Vektors basierend auf dem Ti-Plasmid: PP – Restriktionsenzymverdauung

Die zweite Methode basiert auf der Erstellung eines Systems binärer (doppelter) Vektoren.

Neuere Studien haben gezeigt, dass für die Infektion und Transformation nicht das gesamte Ti-Plasmid benötigt wird, sondern nur die Grenzregionen der T-DNA und eine für die Virulenz verantwortliche Region des Ti-Plasmids ausreichen. Darüber hinaus müssen sich diese beiden DNA-Regionen nicht im selben Plasmid befinden. Wenn Agrobakterienzellen ein Ti-Plasmid mit einem Vir-Segment und ein weiteres T-DNA-Plasmid enthalten, können diese Bakterien Pflanzenzellen transformieren. Gleichzeitig integriert sich T-DNA mit allen darin eingebetteten Genen in das Pflanzengenom; hierfür ist keine homologe Rekombination in Bakterienzellen erforderlich. Um die Expression fremder Gene durchzuführen, wird ein spezifischer T-DNA-Promotor benötigt, beispielsweise der Nopalin-Synthetase-Promotor.

Es hat sich gezeigt, dass es in Pflanzenzellen funktioniert und in weit verbreiteten Ti-Plasmid-Subklonen leicht mit der kodierenden Sequenz eines fremden Gens verknüpft werden kann. Ein weiterer Vorteil dieses Promotors besteht darin, dass er in Calli und in den meisten Pflanzenorganen funktioniert. Die Effizienz der Transformation mit Hilfe der veränderten T-DNA von Agrobakterien ist derzeit allen anderen Methoden des Gentransfers in die Pflanze überlegen.

Über die Mechanismen, mit denen das Agrobacterium die T-DNA des Pflanzenkerns überträgt, ist nur sehr wenig bekannt: Die T-Segmente der DNA von Octopin- und Nopalin-Plasmiden werden an verschiedenen, scheinbar zufälligen Stellen auf den Wirtschromosomen eingefügt, tun dies jedoch nie integrieren sich in mitochondriale DNA und Chloroplasten.

Um manipulierte Ti-Plasmide in eine Pflanzenzelle einzuführen, können verschiedene Methoden verwendet werden. Die einfachste dieser natürlichen Methoden ist die Inokulation manipulierter Stämme in beschädigte (verletzte) Bereiche der Pflanze.

Eine andere Methode besteht darin, Protoplasten durch Kokultivierung mit Agrobakterien zu transformieren. Die Kokultivierungstechnik kann als Tumorinduktion unter künstlichen Bedingungen betrachtet werden: Virulente Agrobakterien werden vorübergehend mit Protoplasten kokultiviert. Wenn Agrobakterien zu frisch isolierten oder einen Tag alten Protoplasten hinzugefügt werden, wird weder eine bakterielle Anheftung noch eine Transformation beobachtet. Eine wesentliche Voraussetzung für die Transformation ist das Vorhandensein neu gebildeter Zellwände in 3 Tage alten Protoplasten. Dies wird durch den Einsatz von Inhibitoren der Zellwandbildung bestätigt, die auch die Anlagerung von Bakterien hemmen. Nach einer Zeit der Kokultivierung (mehr als einen Tag), in der es zur Aggregation von Protoplasten mit Bakterien kommt, werden freie Bakterien durch wiederholtes Waschen entfernt. Darüber hinaus werden Pflanzenzellen auf einem Medium unter Zusatz von Hormonen kultiviert und nach 3-4 Wochen werden kleine Kolonien auf einem hormonfreien Medium ausgesät. Auf diesem Medium überleben nur Kolonien transformierter Zellen.

Auf diese Weise wurden transformierte, regenerierte Tabak- und Petunienpflanzen erhalten. Diese Methode ermöglicht eine deutliche Erweiterung des Wirtsspektrums von Agrobakterien, darunter auch Arten der Getreidefamilie. Die Effizienz der Kokultivierung kann durch den Einsatz von Zellfusionsinduktoren (PEG, Calcium etc.) gesteigert werden.

Die Transformation von Protoplasten kann auch durch direkte Kokultivierung mit Ti-Plasmiden durchgeführt werden; solche Experimente wurden mit Petunien- und Tabak-Protoplasten durchgeführt. Die in den ersten Experimenten beobachtete sehr geringe Effizienz des T-DNA-Einbaus in Protoplasten wurde dann durch chemische Stimulation (PEG) gesteigert. Aus den transformierten Zellen wurden transgene Pflanzen gewonnen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass keine Zwischenvektoren erforderlich sind. Erfolge in der Pflanzengenetik

Die ersten transgenen Pflanzen (Tabakpflanzen mit eingefügten Genen von Mikroorganismen) wurden 1983 gewonnen. Die ersten erfolgreichen Feldversuche mit transgenen Pflanzen (gegen Virusinfektionen resistente Tabakpflanzen) wurden bereits 1986 in den USA durchgeführt.

Nachdem alle erforderlichen Tests auf Toxizität, Allergenität, Mutagenität usw. bestanden wurden. Die ersten transgenen Produkte wurden 1994 in den USA auf den Markt gebracht. Dabei handelte es sich um die verzögert reifenden Flavr Savr-Tomaten von Calgen und die herbizidresistenten Sojabohnen von Monsanto. Innerhalb von 1-2 Jahren brachten Biotech-Firmen eine Reihe gentechnisch veränderter Pflanzen auf den Markt: Tomaten, Mais, Kartoffeln, Tabak, Sojabohnen, Raps, Zucchini, Radieschen, Baumwolle.

Derzeit sind weltweit Hunderte kommerzielle Unternehmen mit einem Gesamtkapital von mehr als hundert Milliarden Dollar an der Gewinnung und Erprobung gentechnisch veränderter Pflanzen beteiligt. Im Jahr 1999 wurden transgene Pflanzen auf einer Gesamtfläche von etwa 40 Millionen Hektar gepflanzt, was größer ist als die Fläche eines Landes wie Großbritannien. In den USA machen gentechnisch veränderte Pflanzen (GV-Pflanzen) mittlerweile etwa 50 % des Mais- und Sojabohnenanbaus und mehr als 30–40 % des Baumwollanbaus aus. Dies deutet darauf hin, dass die gentechnisch veränderte Pflanzenbiotechnologie bereits zu einem wichtigen Industriezweig für die Produktion von Nahrungsmitteln und anderen nützlichen Produkten geworden ist und erhebliche Arbeitskräfte und Finanzströme anzieht. In den kommenden Jahren wird mit einem weiteren rasanten Anstieg der Fläche transgener Kulturpflanzenformen gerechnet.

Die erste Welle transgener Pflanzen, die für den praktischen Einsatz zugelassen wurden, enthielten zusätzliche Gene für Resistenz (gegen Krankheiten, Herbizide, Schädlinge, Verderb bei der Lagerung und Stress).

Der aktuelle Entwicklungsstand der Pflanzengentechnik wird als „Metabolic Engineering“ bezeichnet. Dabei besteht die Aufgabe nicht so sehr darin, bestimmte bestehende Eigenschaften der Pflanze zu verbessern, wie in der traditionellen Züchtung, sondern vielmehr darin, der Pflanze beizubringen, völlig neue Verbindungen zu produzieren, die in der Medizin, der chemischen Produktion und anderen Bereichen eingesetzt werden. Bei diesen Verbindungen kann es sich beispielsweise um spezielle Fettsäuren, nützliche Proteine mit einem hohen Gehalt an essentiellen Aminosäuren, modifizierte Polysaccharide, essbare Impfstoffe, Antikörper, Interferone und andere „Wirkstoff“-Proteine, neue umweltfreundliche Polymere und vieles mehr handeln. Durch den Einsatz transgener Pflanzen ist es möglich, eine großtechnische und kostengünstige Produktion solcher Stoffe zu etablieren und sie dadurch einem breiten Konsum zugänglicher zu machen.

Verbesserung der Qualität von Speicherproteinen

Die Speicherproteine der wichtigsten Kulturarten werden von einer Familie eng verwandter Gene kodiert. Die Akkumulation von Samenspeicherproteinen ist ein komplexer biosynthetischer Prozess. Der erste gentechnische Versuch, die Eigenschaften einer Pflanze durch Einführung eines Speicherprotein-Gens einer anderen Pflanze zu verbessern, wurde 1983 von D. Kemp und T. Hall in den USA durchgeführt. Das Bohnen-Phaseolin-Gen wurde mithilfe eines Ti-Plasmids in das Sonnenblumengenom übertragen. Das Ergebnis dieses Experiments war nur eine chimäre Pflanze namens Sanbin. In Sonnenblumenzellen wurden immunologisch verwandte Phaseolin-Polypeptide gefunden, was die Tatsache des Gentransfers zwischen Pflanzen verschiedener Familien bestätigte

Später wurde das Phaseolin-Gen auf Tabakzellen übertragen: In regenerierten Pflanzen wurde das Gen in allen Geweben exprimiert, wenn auch in geringen Mengen. Die unspezifische Expression des Phaseolin-Gens, wie im Fall seiner Übertragung auf Sonnenblumenzellen, unterscheidet sich stark von der Expression dieses Gens in reifen Bohnenkeimblättern, wo Phaseolin 25–50 % des Gesamtproteins ausmachte. Diese Tatsache weist auf die Notwendigkeit hin, andere regulatorische Signale dieses Gens während der Konstruktion chimärer Pflanzen zu bewahren, und auf die Bedeutung der Kontrolle der Genexpression im Prozess der Pflanzenontogenese.

Das für das Maisspeicherprotein Zein kodierende Gen wurde nach seiner Integration in die T-DNA wie folgt in das Sonnenblumengenom übertragen. Agrobacterium-Stämme, die Ti-Plasmide mit dem Zein-Gen enthielten, wurden verwendet, um Tumore in Sonnenblumenstängeln zu induzieren. Einige der erhaltenen Tumoren enthielten aus Maisgenen synthetisierte mRNA, was Anlass gibt, diese Ergebnisse als ersten Beweis für die Transkription eines Monokotyledonen-Gens in einem Dikotyledonen zu betrachten. Das Vorhandensein von Zein-Protein in Sonnenblumengeweben wurde jedoch nicht nachgewiesen.

Eine realistischere Aufgabe der Gentechnik besteht darin, die Aminosäurezusammensetzung von Proteinen zu verbessern. Bekanntlich mangelt es im Speicherprotein der meisten Getreidearten an Lysin, Threonin, Tryptophan, bei Hülsenfrüchten an Methionin und Cystein. Die Einführung zusätzlicher Mengen an mangelhaften Aminosäuren in diese Proteine könnte das Aminosäureungleichgewicht beseitigen. Durch traditionelle Züchtungsmethoden ist es gelungen, den Gehalt an Lysin in den Speicherproteinen von Getreide deutlich zu steigern. In all diesen Fällen wurde ein Teil der Prolamine (alkohollösliche Speicherproteine von Getreide) durch andere Proteine ersetzt, die viel Lysin enthalten. Allerdings nahm bei solchen Pflanzen die Korngröße ab und der Ertrag sank. Anscheinend sind Prolamine für die Bildung von normalem Getreide notwendig und ihr Ersatz durch andere Proteine wirkt sich negativ auf den Ertrag aus. Vor diesem Hintergrund ist zur Verbesserung der Qualität des Getreidespeicherproteins ein Protein erforderlich, das nicht nur einen hohen Gehalt an Lysin und Threonin aufweist, sondern auch einen bestimmten Teil der Prolamine bei der Kornbildung vollständig ersetzen kann.

Pflanzen können auch tierische Proteine produzieren. So führte die Einfügung eines chimären Gens, das aus einem Teil des Arabidopsis-25-Protein-Gens und dem kodierenden Teil für das Neuropeptid Enkephalin besteht, in das Genom von Arabidopsis thaliana und Brassica napus zur Synthese des chimären Proteins von bis zu 200 ng pro 1 g von Saatgut. Zwei Strukturproteindomänen wurden durch eine von Trypsin erkannte Sequenz verbunden, was die weitere einfache Isolierung von reinem Enkephalin ermöglichte.

In einem anderen Experiment gelang es nach der Kreuzung transgener Pflanzen, in die eine das Gen für die Gamma-Untereinheit und in die zweite das Gen für die Kappa-Untereinheit des Immunglobulins eingefügt wurde, die Expression beider Ketten in den Nachkommen zu erhalten. Dadurch bildete die Pflanze Antikörper, die bis zu 1,3 % des gesamten Blattproteins ausmachten. Es wurde auch gezeigt, dass in Tabakpflanzen voll funktionsfähige sekretorische monoklonale Immunglobuline gebildet werden können. Sekretorische Immunglobuline werden normalerweise in die Mundhöhle und den Magen von Menschen und Tieren abgesondert und dienen als erste Barriere gegen Darminfektionen. In der oben erwähnten Arbeit wurden monoklonale Antikörper in Pflanzen hergestellt, die spezifisch für Streptococcus mutans waren, Bakterien, die Zahnkaries verursachen. Es wird davon ausgegangen, dass auf Basis solcher monoklonaler Antikörper, die von transgenen Pflanzen produziert werden, eine wirklich karieshemmende Zahnpasta hergestellt werden kann. Von anderen tierischen Proteinen von medizinischem Interesse wurde die Produktion von menschlichem β-Interferon in Pflanzen nachgewiesen.

Es wurden auch Ansätze entwickelt, bakterielle Antigene in Pflanzen zu gewinnen und als Impfstoffe zu verwenden. Es wurde eine Kartoffel erhalten, die Oligomere der ungiftigen Cholera-β-Toxin-Untereinheit exprimiert. Aus diesen transgenen Pflanzen könnte ein günstiger Cholera-Impfstoff hergestellt werden.

Fette

Fettsäuren, der Hauptbestandteil von Pflanzenöl, sind die wichtigsten Rohstoffe für die Gewinnung verschiedener Arten von Chemikalien. In ihrer Struktur handelt es sich um Kohlenstoffketten, die je nach Länge und Sättigungsgrad der Kohlenstoffbindungen unterschiedliche physikalisch-chemische Eigenschaften aufweisen. Im Jahr 1995 wurde die experimentelle Verifizierung abgeschlossen und von den US-Bundesbehörden die Genehmigung für den Anbau und die kommerzielle Nutzung transgener Rapspflanzen mit einer veränderten Zusammensetzung an Pflanzenölen eingeholt, darunter neben herkömmlichen 16- und 18-gliedrigen Fettsäuren auch Up bis 45 % der 12-gliedrigen Fettsäuren. - Laureat. Dieser Stoff wird häufig zur Herstellung von Waschpulvern, Shampoos und Kosmetika verwendet.

Die experimentelle Arbeit bestand darin, dass das spezifische Thioesterase-Gen aus der Pflanze Umbellularia califomica kloniert wurde, wo der Lauratgehalt im Samenfett 70 % erreichte. Der strukturelle Teil des Gens dieses Enzyms wurde unter der Kontrolle des Promotor-Terminators des für das frühe Stadium der Samenbildung spezifischen Proteingens in das Genom von Raps und Arabidopsis eingefügt, was zu einer Erhöhung des Gehalts führte Laurat im Öl dieser Pflanzen.

Unter anderen Projekten im Zusammenhang mit der Veränderung der Zusammensetzung von Fettsäuren sind Arbeiten zu nennen, die darauf abzielen, den Gehalt an ungesättigten Fettsäuren in Pflanzenöl zu erhöhen oder zu verringern. Interessant sind Experimente mit Petroselinsäure, einem Isomer der Ölsäure, bei dem sich die Doppelbindung hinter dem sechsten Kohlenstoffglied befindet. Diese Fettsäure ist Teil der Zusammensetzung des Korianderöls und bestimmt dessen höheren Schmelzpunkt (33 °C), während der Schmelzpunkt in Gegenwart von Ölsäure nur 12 °C beträgt. Es wird davon ausgegangen, dass nach der Übertragung von Genen, die die Synthese von Petroselinsäure bestimmen, in Pflanzen – Produzenten von Pflanzenölen – die Herstellung von Nahrungsmargarine mit einer ungesättigten Fettsäure möglich sein wird. Darüber hinaus ist es sehr einfach, aus Petroselinsäure durch Oxidation mit Ozon Laurat zu gewinnen. Eine weitere Untersuchung der Besonderheiten der biochemischen Synthese von Fettsäuren wird offenbar dazu führen, dass diese Synthese gesteuert werden kann, um Fettsäuren unterschiedlicher Länge und Sättigungsgrad zu erhalten, was die Produktion von Waschmitteln, Kosmetika und Süßwaren erheblich verändern wird , Härter, Schmierstoffe, Medikamente, Polymere, Dieselkraftstoff und vieles mehr, was mit der Verwendung von Kohlenwasserstoff-Rohstoffen verbunden ist.

Polysaccharide

Derzeit wird an der Schaffung transgener Kartoffelpflanzen und anderer stärkeanreichernder Pflanzen gearbeitet, bei denen dieser Stoff hauptsächlich in Form von Amylopektin, also einer verzweigten Form der Stärke, oder überwiegend nur in Form von Amylose, also linear, vorliegt Formen von Stärke. Die Lösung von Amylopektin in Wasser ist flüssiger und transparenter als die von Amylose, die bei Wechselwirkung mit Wasser ein starres Gel bildet. So dürfte beispielsweise Stärke, die hauptsächlich aus Amylopektin besteht, auf dem Markt der Hersteller verschiedener Nährstoffmischungen gefragt sein, wo derzeit modifizierte Stärke als Füllstoff verwendet wird. Auch das Genom von Plastiden und Mitochondrien kann genetisch verändert werden. Solche Systeme können den Produktgehalt im transgenen Material deutlich erhöhen.

Schaffung herbizidresistenter Pflanzen

In neuen, intensiven Agrartechnologien werden Herbizide sehr häufig eingesetzt. Es hängt damit zusammen. dass die früheren umweltschädlichen Breitbandherbizide, die für Säugetiere giftig sind und lange in der äußeren Umwelt verbleiben, durch neue, fortschrittlichere und sicherere Verbindungen ersetzt werden. Sie haben jedoch einen Nachteil: Sie hemmen das Wachstum nicht nur von Unkräutern, sondern auch von Kulturpflanzen. Hochwirksame Herbizide wie Glyphosat und Atrazine werden intensiv untersucht, um den Mechanismus der Toleranz gegenüber ihnen bei einigen Unkräutern zu identifizieren. Daher treten in Bereichen, in denen Atrazin häufig eingesetzt wird, bei vielen Pflanzenarten häufig Atrazin-resistente Biotypen auf.

Die Untersuchung des Herbizidresistenzmechanismus, um durch Gentechnik Kulturpflanzen mit dieser Eigenschaft zu erhalten, umfasst die folgenden Schritte: Identifizierung biochemischer Ziele der Herbizidwirkung in einer Pflanzenzelle; Auswahl von Organismen, die gegen ein bestimmtes Herbizid resistent sind, als Quellen für Resistenzgene; Klonen dieser Gene; Einführung in Kulturpflanzen und Untersuchung ihrer Funktionsweise

Es gibt vier grundlegend unterschiedliche Mechanismen, die eine Resistenz gegen bestimmte chemische Verbindungen, einschließlich Herbizide, bewirken können: Transport, Eliminierung, Regulierung und Kontakt. Der Transportmechanismus der Resistenz besteht darin, dass das Herbizid nicht in die Zelle eindringen kann. Unter der Wirkung des Eliminierungsmechanismus der Resistenz können in die Zelle gelangte Substanzen mit Hilfe induzierbarer zellulärer Faktoren, meist abbauender Enzyme, zerstört werden und auch die eine oder andere Art von Modifikation erfahren, wodurch inaktive Produkte entstehen, die für die Zelle harmlos sind Zelle. Bei regulatorischer Resistenz beginnt die intensive Synthese eines Proteins oder Zellenzyms, das unter der Wirkung eines Herbizids inaktiviert wird, wodurch der Mangel des gewünschten Metaboliten in der Zelle beseitigt wird. Der Kontaktmechanismus der Resistenz wird durch eine Veränderung der Struktur des Ziels (Protein oder Enzym) bereitgestellt, deren Wechselwirkung mit der schädigenden Wirkung des Herbizids verbunden ist.

Es wurde festgestellt, dass das Merkmal der Herbizidresistenz monogen ist, das heißt, das Merkmal wird am häufigsten durch ein einzelnes Gen bestimmt. Dies erleichtert die Möglichkeit, mithilfe rekombinanter DNA-Technologie dieses Merkmal zu übertragen, erheblich. Gene, die für verschiedene Enzyme zum Abbau und zur Modifikation von Herbiziden kodieren, können erfolgreich genutzt werden, um durch Gentechnik herbizidresistente Pflanzen zu erzeugen.

Herkömmliche Züchtungsmethoden zur Herstellung herbizidresistenter Sorten sind sehr zeitaufwändig und ineffektiv. Das im Ausland am häufigsten verwendete Herbizid Glyphosat (Handelsname Roundup) hemmt die Synthese der wichtigsten aromatischen Aminosäuren, indem es auf das Enzym 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSP-Synthase) einwirkt. Bekannte Fälle von Resistenz gegen dieses Herbizid sind entweder mit einer Erhöhung des Syntheseniveaus dieses Enzyms (Regulationsmechanismus) oder mit dem Auftreten eines mutierten Enzyms verbunden, das gegenüber Glyphosphat unempfindlich ist (Kontaktmechanismus). Das EPSP-Synthase-Gen wurde aus Glyphosphat-resistenten Pflanzen isoliert und unter den Promotor des Blumenkohlmosaikvirus gelegt. Mithilfe des Ti-Plasmids wurde dieses genetische Konstrukt in Petunienzellen eingeschleust. In Gegenwart einer Kopie des Gens in Pflanzen, die aus transformierten Zellen regeneriert wurden, wurde das Enzym 20–40-mal häufiger synthetisiert als in den ursprünglichen Pflanzen, die Glyphosphatresistenz erhöhte sich jedoch nur um das Zehnfache.

Atrazin ist eines der am häufigsten zur Behandlung von Nutzpflanzen eingesetzten Herbizide. Es hemmt die Photosynthese, indem es an eines der Proteine des Photosystems II bindet und den Elektronentransport stoppt. Die Herbizidresistenz entsteht durch Punktmutationen in diesem Plastoquinon-bindenden Protein (Ersatz von Serin durch Glycin), wodurch es seine Fähigkeit zur Interaktion mit dem Herbizid verliert. In einigen Fällen gelang es, das mutierte Proteingen mithilfe eines Ti-Plasmids in Atrazin-empfindliche Pflanzen zu übertragen. Das in das Pflanzenchromosom integrierte Resistenzgen wurde mit einer Signalsequenz versehen, die den Transport des synthetisierten Proteins in Chloroplasten sicherstellte. Die chimären Pflanzen zeigten eine signifikante Resistenz gegenüber Atrazinkonzentrationen, die zum Absterben der Kontrollpflanzen mit dem Wildtyp-Protein-Gen führten. Einige Pflanzen sind in der Lage, Atrazin durch Abspaltung des Chlorrestes durch das Enzym Glutathion-S-Transferase zu inaktivieren. Das gleiche Enzym inaktiviert auch andere verwandte Herbizide der Triazinreihe (Propazin, Simazin usw.).

Es gibt Pflanzen, deren natürliche Resistenz gegen Herbizide auf der Entgiftung beruht. Somit kann die Pflanzenresistenz gegen Chlorsulfuron mit der Deaktivierung des Herbizidmoleküls durch seine Hydroxylierung und anschließende Glykosylierung der eingeführten Hydroxylgruppe verbunden sein. Entwicklung von Pflanzen, die gegen Krankheitserreger und Schädlinge resistent sind Die Resistenz von Pflanzen gegen verschiedene Krankheitserreger ist meist ein komplexes Multigenmerkmal.

Die gleichzeitige Übertragung mehrerer Loci ist selbst mit gentechnischen Methoden schwierig, ganz zu schweigen von klassischen Selektionsmethoden. Der andere Weg ist einfacher. Es ist bekannt, dass sich der Stoffwechsel resistenter Pflanzen verändert, wenn sie von Krankheitserregern befallen werden. Es reichern sich Verbindungen wie H2O2, Salicylsäure und Phytoallexine an. Ein erhöhter Gehalt dieser Verbindungen trägt zur Widerstandskraft der Pflanze im Kampf gegen Krankheitserreger bei.

Hier ist ein Beispiel, das die Rolle von Salicylsäure bei der Immunantwort von Pflanzen belegt. Transgene Tabakpflanzen, die das bakterielle Gen enthalten, das die Synthese von Salicylathydrolase (dieses Enzym spaltet Salicylsäure) steuert, waren nicht in der Lage, eine Immunantwort auszulösen. Daher könnte eine gentechnisch veränderte Veränderung des Salicylsäurespiegels oder der Salicylsäureproduktion in Pflanzen als Reaktion auf den H2O2-Erreger vielversprechend für die Schaffung resistenter transgener Pflanzen sein.

In der Phytovirologie ist das Phänomen der induzierten Kreuzresistenz von Pflanzen gegen Virusinfektionen weithin bekannt. Der Kern dieses Phänomens besteht darin, dass die Infektion einer Pflanze mit einem Virusstamm eine spätere Infektion dieser Pflanzen mit einem anderen Virusstamm verhindert. Der molekulare Mechanismus der Unterdrückung von Virusinfektionen ist noch unklar. Es hat sich gezeigt, dass die Einführung einzelner viraler Gene, beispielsweise Gene für Kapsidproteine, für die Pflanzenimmunisierung ausreichend ist. So wurde das Gen für das Hüllprotein des Tabakmosaikvirus in Tabakzellen übertragen und transgene Pflanzen gewonnen, in denen 0,1 % aller Blattproteine durch das Virusprotein repräsentiert wurden. Ein erheblicher Teil dieser Pflanzen zeigte bei einer Infektion mit dem Virus keine Krankheitssymptome. Es ist möglich, dass das in den Zellen synthetisierte virale Hüllprotein verhindert, dass die virale RNA normal funktioniert und vollwertige Viruspartikel bildet. Es wurde festgestellt, dass die Expression des Kapsidproteins des Tabakmosaikvirus, des Alfalfa-Mosaikvirus, des Gurkenmosaikvirus und des Kartoffel-X-Virus in den entsprechenden transgenen Pflanzen (Tabak, Tomaten, Kartoffeln, Gurken, Paprika) ein hohes Maß an Proteinen liefert Schutz vor einer späteren Virusinfektion. Darüber hinaus kam es bei den transformierten Pflanzen zu keiner Abnahme der Fruchtbarkeit und zu unerwünschten Veränderungen im Wachstum und in den physiologischen Eigenschaften der ursprünglichen Exemplare und ihrer Nachkommen. Es wird angenommen, dass die induzierte Resistenz von Pflanzen gegen Viren auf ein spezielles antivirales Protein zurückzuführen ist, das tierischem Interferon sehr ähnlich ist. Durch Gentechnik scheint es möglich, die Expression des für dieses Protein kodierenden Gens zu steigern, indem man es verstärkt oder durch einen stärkeren Promotor ersetzt.

Es ist zu beachten, dass der Einsatz der Gentechnik zum Schutz von Pflanzen vor verschiedenen pathogenen Mikroorganismen weitgehend durch mangelnde Kenntnisse über die Mechanismen pflanzlicher Abwehrreaktionen erschwert wird. Insektizide werden zur Bekämpfung von Insektenschädlingen im Pflanzenbau eingesetzt. Sie wirken sich jedoch schädlich auf Säugetiere aus, töten nützliche Insekten, verschmutzen die Umwelt und Straßen und außerdem gewöhnen sich Insekten schnell an sie. Es ist bekannt, dass mehr als 400 Insektenarten gegen die verwendeten Insektizide resistent sind. Daher gewinnen biologische Bekämpfungsmittel immer mehr an Bedeutung, da sie eine strenge Selektivität der Wirkung und eine mangelnde Anpassung der Schädlinge an das eingesetzte Biopestizid gewährleisten.

Es ist seit langem bekannt, dass das Bakterium Bacillus thuringiensis ein Protein produziert, das für viele Insektenarten sehr giftig, gleichzeitig aber für Säugetiere ungefährlich ist. Das Protein (Delta-Endotoxin, CRY-Protein) wird von verschiedenen Stämmen von B. thuringiensis produziert. Die Wechselwirkung des Toxins mit Rezeptoren ist streng spezifisch, was die Auswahl der Toxin-Insekten-Kombination erschwert. In der Natur wurden zahlreiche Stämme von B. thuringiensis gefunden, deren Toxine nur auf bestimmte Insektenarten wirken. Präparate von B. thuringiensis werden seit Jahrzehnten zur Bekämpfung von Insekten auf Feldern eingesetzt. Die Sicherheit des Toxins und seiner Proteinbestandteile für Menschen und andere Säugetiere wurde vollständig nachgewiesen. Die Einfügung des Gens dieses Proteins in das Pflanzengenom ermöglicht die Gewinnung transgener Pflanzen, die nicht von Insekten gefressen werden.

Neben der Speziesspezifität hinsichtlich ihrer Wirkung auf Insekten führte die Insertion prokaryontischer Deltatoxin-Gene in das Pflanzengenom selbst unter der Kontrolle starker eukaryontischer Promotoren nicht zu einem hohen Expressionsniveau. Vermutlich ist dieses Phänomen darauf zurückzuführen, dass diese Bakteriengene deutlich mehr Adenin- und Thymin-Nukleotidbasen enthalten als Pflanzen-DNA. Dieses Problem wurde durch die Schaffung modifizierter Gene gelöst, bei denen bestimmte Fragmente aus dem natürlichen Gen herausgeschnitten und hinzugefügt wurden, während die Domänen, die die aktiven Teile des Delta-Toxins codieren, erhalten blieben. Mit solchen Ansätzen wurden beispielsweise Kartoffeln gewonnen, die gegen den Kartoffelkäfer resistent sind. Es wurden transgene Tabakpflanzen erhalten, die in der Lage sind, das Toxin zu synthetisieren. Solche Pflanzen waren gegenüber Manduca sexta-Raupen unempfindlich. Letztere starben innerhalb von 3 Tagen nach Kontakt mit toxinproduzierenden Pflanzen. Als dominantes Merkmal wurde die Toxinbildung und die daraus resultierende Insektenresistenz vererbt.

Derzeit machen die sogenannten Bt-Pflanzen (von B. thuringiensis) aus Baumwolle und Mais den Großteil der Gesamtmenge an gentechnisch veränderten Pflanzen dieser Nutzpflanzen aus, die auf den Feldern der USA angebaut werden.

Im Zusammenhang mit den Möglichkeiten der Gentechnik, entomopathogene Pflanzen auf Basis eines Toxins mikrobiellen Ursprungs zu gestalten, sind Toxine pflanzlichen Ursprungs von noch größerem Interesse. Phytotoxine sind Inhibitoren der Proteinsynthese und erfüllen eine Schutzfunktion gegen Schadinsekten, Mikroorganismen und Viren. Das am besten untersuchte unter ihnen ist Ricin, das in Rizinusbohnen synthetisiert wird: Sein Gen wurde geklont und die Nukleotidsequenz wurde ermittelt. Die hohe Toxizität von Ricin für Säugetiere beschränkt die gentechnische Arbeit damit jedoch nur auf Industriepflanzen, die nicht für die Lebens- und Tierernährung genutzt werden. Das von American Phytolacca produzierte Toxin wirkt gegen Viren und ist für Tiere ungefährlich. Sein Wirkungsmechanismus besteht darin, die eigenen Ribosomen zu inaktivieren, wenn verschiedene Krankheitserreger, darunter Phytoviren, in die Zellen eindringen. Befallene Zellen werden nekrotisch und verhindern so die Vermehrung und Ausbreitung des Erregers in der Pflanze. Derzeit laufen Studien, um das Gen für dieses Protein zu untersuchen und auf andere Pflanzen zu übertragen.

Viruserkrankungen sind bei Insekten weit verbreitet, daher können natürliche Insektenviren, deren Präparate virale Pestizide genannt werden, zur Bekämpfung von Insektenschädlingen eingesetzt werden. Im Gegensatz zu Pestiziden haben sie ein enges Wirkungsspektrum, töten keine Nützlinge ab, werden in der Umwelt schnell zerstört und sind für Pflanzen und Tiere ungefährlich. Neben Insektenviren werden einige Pilze, die Insektenschädlinge infizieren, als Biopestizide eingesetzt. Bei den derzeit verwendeten Biopestiziden handelt es sich um natürliche Stämme entomopathogener Viren und Pilze. Die Möglichkeit, in Zukunft durch gentechnische Methoden neue wirksame Biopestizide zu entwickeln, ist jedoch nicht ausgeschlossen.

Erhöhte Pflanzenresistenz gegenüber Stressbedingungen

Pflanzen sind sehr oft verschiedenen schädlichen Umweltfaktoren ausgesetzt: hohe und niedrige Temperaturen, Feuchtigkeitsmangel, Bodenversalzung und Gasverschmutzung der Umwelt, Mangel oder umgekehrt ein Überschuss an bestimmten Mineralien usw. Es gibt daher viele dieser Faktoren Die Methoden zum Schutz vor ihnen sind vielfältig – von physiologischen Eigenschaften bis hin zu strukturellen Anpassungen zur Überwindung ihrer schädlichen Auswirkungen.

Die Pflanzenresistenz gegenüber einem bestimmten Stressfaktor ist das Ergebnis des Einflusses vieler verschiedener Gene, daher ist es nicht notwendig, über die vollständige Übertragung von Toleranzmerkmalen von einer Pflanzenart auf eine andere durch gentechnische Methoden zu sprechen. Dennoch gibt es durch die Gentechnik gewisse Möglichkeiten, die Pflanzenresistenz zu verbessern. Dies betrifft die Arbeit mit einzelnen Genen, die die Stoffwechselreaktionen von Pflanzen auf Stressbedingungen steuern, beispielsweise die Überproduktion von Prolin als Reaktion auf osmotischen Schock, den Salzgehalt, die Synthese spezifischer Proteine als Reaktion auf Hitzeschock usw. Weitere eingehende Untersuchung der physiologischen , biochemische und genetische Grundlage Die Reaktion einer Pflanze auf Umweltbedingungen wird zweifellos den Einsatz gentechnischer Methoden zur Konstruktion resistenter Pflanzen ermöglichen.

Bisher ist nur ein indirekter Ansatz zur Gewinnung frostresistenter Pflanzen durch gentechnische Manipulationen mit Pseudomonas syringae erkennbar. Dieser mit Pflanzen koexistierende Mikroorganismus trägt zu deren Schädigung durch Frühfröste bei. Der Mechanismus des Phänomens beruht auf der Tatsache, dass die Zellen des Mikroorganismus ein spezielles Protein synthetisieren, das in der äußeren Membran lokalisiert ist und das Zentrum der Eiskristallisation darstellt. Es ist bekannt, dass die Eisbildung im Wasser von Substanzen abhängt, die als Zentren der Eisbildung dienen können. Das Protein, das die Bildung von Eiskristallen in verschiedenen Teilen der Pflanze (Blätter, Stängel, Wurzeln) verursacht, ist einer der Hauptfaktoren für die Schädigung des Gewebes von Pflanzen, die anfällig für Frühfröste sind. Zahlreiche Experimente unter streng kontrollierten Bedingungen haben gezeigt, dass sterile Pflanzen durch Fröste bis -6-8°C nicht geschädigt wurden, während Pflanzen mit der entsprechenden Mikroflora bereits bei Temperaturen von -1,5-2°C geschädigt wurden. Mutanten dieser Bakterien, jene die die Fähigkeit verloren, das Protein zu synthetisieren, das die Bildung von Eiskristallen verursacht, erhöhten die Temperatur der Eisbildung nicht und Pflanzen mit einer solchen Mikroflora waren frostbeständig. Ein über Kartoffelknollen gesprühter Bakterienstamm konkurrierte mit gewöhnlichen Bakterien, was zu einer Erhöhung der Frostbeständigkeit der Pflanzen führte. Es ist möglich, dass solche Bakterien, die mit gentechnischen Methoden erzeugt und als Bestandteil der äußeren Umgebung eingesetzt werden, der Frostbekämpfung dienen.

Steigerung der Effizienz der biologischen Stickstofffixierung

Das Enzym, das für die Reduktion von molekularem Stickstoff zu Ammonium verantwortlich ist, wurde gut untersucht. - Nitrogenase. Die Struktur der Nitrogenase ist in allen stickstofffixierenden Organismen gleich. Eine unverzichtbare physiologische Voraussetzung bei der Stickstofffixierung ist der Schutz der Nitrogenase vor der Zerstörung durch Sauerstoff. Die am besten untersuchten Stickstofffixierer sind Rhizobien, die eine Symbiose mit Hülsenfrüchten und dem frei lebenden Bakterium Klebsiella pneumoniae eingehen. Es wurde festgestellt, dass 17 Gene, die sogenannten nif-Gene, bei diesen Bakterien für die Stickstofffixierung verantwortlich sind. Alle diese Gene sind miteinander verknüpft und liegen auf dem Chromosom zwischen den Genen für Histidin-Biosynthese-Enzyme und den Genen, die die Aufnahme von Shikimisäure bestimmen. In einer schnell wachsenden Rhizobie liegen nif-Gene in Form eines Megaplasmids vor, das 200–300.000 Basenpaare enthält.

Unter den Stickstofffixierungsgenen wurden Gene identifiziert, die die Struktur der Nitrogenase steuern, eines Proteinfaktors, der am Elektronentransport beteiligt ist, sowie regulatorische Gene. Die Regulation der Stickstofffixierungsgene ist recht komplex, daher wird die gentechnische Übertragung der Stickstofffixierungsfunktion von Bakterien direkt auf höhere Pflanzen derzeit nicht mehr diskutiert. Wie Experimente gezeigt haben, war es selbst im einfachsten eukaryotischen Organismus – der Hefe – nicht möglich, die Expression von nif-Genen zu erreichen, obwohl diese 50 Generationen lang bestehen blieben.

Diese Experimente zeigten, dass Diazotrophie (Stickstofffixierung) ausschließlich für prokaryotische Organismen charakteristisch ist und dass nif-Gene die Barriere zwischen Prokaryoten und Eukaryoten aufgrund ihrer zu komplexen Struktur und Regulierung durch Gene außerhalb der nif-Region nicht überwinden konnten. Möglicherweise gelingt der Transfer von nif-Genen mit Hilfe von Ti-Plasmiden in Chloroplasten erfolgreicher, da die Mechanismen der Genexpression in Chloroplasten und in prokaryotischen Zellen ähnlich sind. In jedem Fall muss die Nitrogenase vor der hemmenden Wirkung von Sauerstoff geschützt werden. Darüber hinaus ist die Fixierung von Luftstickstoff ein sehr energieintensiver Prozess. Es ist unwahrscheinlich, dass eine Pflanze unter dem Einfluss von NiF-Genen ihren Stoffwechsel so radikal verändern kann, dass all diese Bedingungen geschaffen werden. Allerdings ist es möglich, dass in Zukunft mit gentechnischen Methoden ein wirtschaftlicher arbeitender Nitrogenase-Komplex geschaffen werden kann.

Es ist realistischer, gentechnische Methoden zur Lösung folgender Probleme einzusetzen: Erhöhung der Fähigkeit von Rhizobien, Hülsenfrüchte zu besiedeln, Erhöhung der Effizienz der Stickstofffixierung und -assimilation durch Beeinflussung des genetischen Mechanismus, Schaffung neuer stickstofffixierender Mikroorganismen durch Einführung von nif-Genen in Sie übertragen die Fähigkeit zur Symbiose von Hülsenfrüchten auf andere.

Die Hauptaufgabe der Gentechnik zur Steigerung der Effizienz der biologischen Stickstofffixierung besteht in der Schaffung von Rhizobienstämmen mit verbesserter Stickstofffixierung und Kolonisierungsfähigkeit. Die Besiedlung von Hülsenfrüchten durch Rhizobien verläuft sehr langsam, nur in wenigen Fällen bilden sich Knöllchen. Dies liegt daran, dass der Ort der Rhizobieninvasion nur ein kleiner Bereich zwischen dem Wurzelwachstumspunkt und dem Wurzelhaar ist, das ihm am nächsten liegt und sich im Stadium der Bildung befindet. Alle anderen Wurzelteile und die entwickelten Wurzelhaare der Pflanze sind unempfindlich gegenüber einer Besiedlung. In einigen Fällen sind gebildete Knötchen nicht in der Lage, Stickstoff zu binden, was von vielen Pflanzengenen abhängt (mindestens fünf wurden identifiziert), insbesondere von einer ungünstigen Kombination zweier rezessiver Gene.

Mithilfe traditioneller Genetik- und Züchtungsmethoden war es möglich, im Labor hergestellte Rhizobienstämme mit einer höheren Kolonisierungsfähigkeit zu erhalten. Aber sie erfahren auf dem Feld Konkurrenz durch lokale Sorten. Die Steigerung ihrer Wettbewerbsfähigkeit kann offenbar durch gentechnische Methoden erreicht werden. Eine Steigerung der Effizienz des Stickstofffixierungsprozesses ist durch gentechnische Techniken möglich, die auf der Erhöhung der Genkopien, der Verbesserung der Transkription derjenigen Gene, deren Produkte einen „Engpass“ im Stickstbilden, durch Einführung stärkerer Promotoren usw. basieren. Das ist wichtig um die Effizienz des Nitrogenase-Systems zu steigern, das molekularen Stickstoff direkt zu Ammoniak reduziert.

Verbesserung der Effizienz der Photosynthese

C4-Pflanzen zeichnen sich durch hohe Wachstumsraten und Photosyntheserate aus, sie haben praktisch keine sichtbare Photorespiration. Die meisten landwirtschaftlichen Nutzpflanzen, die zu C3-Pflanzen gehören, weisen eine hohe Photorespirationsintensität auf. Photosynthese und Photorespiration sind eng verwandte Prozesse, die auf der bifunktionellen Aktivität desselben Schlüsselenzyms, der Ribulosebisphosphatcarboxylase (RuBPC), basieren. RuBF-Carboxylase kann nicht nur CO2, sondern auch O2 anbinden, d. h. sie führt Carboxylierungs- und Oxygenierungsreaktionen durch. Durch die RuBF-Oxygenierung entsteht Phosphoglykolat, das als Hauptsubstrat für die Photoatmung dient, den Prozess der CO2-Freisetzung im Licht, wodurch einige Photosyntheseprodukte verloren gehen. Eine geringe Photorespiration bei C4-Pflanzen wird nicht durch das Fehlen von Enzymen des Glykolatwegs erklärt, sondern durch die Einschränkung der Oxygenase-Reaktion sowie durch die Reassimilation von CO2 durch Photorespiration.

Eine der Aufgaben der Gentechnik besteht darin, die Möglichkeit zu untersuchen, RuBPC mit vorherrschender Carboxylaseaktivität zu erzeugen.

Gewinnung von Pflanzen mit neuen Eigenschaften

In den letzten Jahren haben Wissenschaftler einen neuen Ansatz zur Herstellung transgener Pflanzen mit „Antisense-RNA“ (umgedrehter oder Antisense-RNA) verwendet, der es ermöglicht, die Funktion des interessierenden Gens zu steuern. In diesem Fall wird bei der Konstruktion eines Vektors eine Kopie der DNA (cDNA) des eingefügten Gens um 180° gedreht. Dadurch entstehen in der transgenen Pflanze ein normales und ein invertiertes mRNA-Molekül, das aufgrund der Komplementarität der normalen mRNA mit dieser einen Komplex bildet und das kodierte Protein nicht synthetisiert wird.

Mit diesem Ansatz konnten transgene Tomatenpflanzen mit verbesserter Fruchtqualität gewonnen werden. Der Vektor enthielt cDNA des PG-Gens, das die Synthese von Polygalacturonase steuert, einem Enzym, das an der Zerstörung von Pektin beteiligt ist, dem Hauptbestandteil des Interzellularraums pflanzlicher Gewebe. Das PG-Genprodukt wird während der Reifezeit von Tomatenfrüchten synthetisiert und eine Erhöhung seiner Menge führt dazu, dass Tomaten weicher werden, was ihre Haltbarkeit deutlich verkürzt. Durch die Deaktivierung dieses Gens in Transgenen konnten Tomatenpflanzen mit neuen Fruchteigenschaften gewonnen werden, die nicht nur viel länger haltbar waren, sondern die Pflanzen selbst auch resistenter gegen Pilzkrankheiten waren.

Der gleiche Ansatz kann zur Regulierung der Reifung von Tomaten angewendet werden. In diesem Fall wird das EFE-Gen (Ethylen-bildendes Enzym), dessen Produkt ein an der Ethylen-Biosynthese beteiligtes Enzym ist, als Ziel verwendet. Ethylen ist ein gasförmiges Hormon, dessen Aufgabe unter anderem darin besteht, den Reifungsprozess von Früchten zu steuern.

Die Strategie von Antisense-Konstrukten wird häufig zur Modifizierung der Genexpression eingesetzt. Diese Strategie dient nicht nur der Gewinnung von Pflanzen mit neuen Eigenschaften, sondern auch der Grundlagenforschung in der Pflanzengenetik. Erwähnenswert ist noch eine weitere Richtung der Pflanzengentechnik, die bis vor kurzem hauptsächlich in der Grundlagenforschung eingesetzt wurde – zur Untersuchung der Rolle von Hormonen bei der Pflanzenentwicklung. Der Kern der Experimente bestand darin, transgene Pflanzen mit einer Kombination bestimmter bakterieller Hormongene zu erhalten, beispielsweise nur iaaM oder ipt usw. Diese Experimente haben wesentlich zum Nachweis der Rolle von Auxinen und Zytokininen bei der Pflanzendifferenzierung beigetragen.

In den letzten Jahren wurde dieser Ansatz in der praktischen Züchtung eingesetzt. Es stellte sich heraus, dass die Früchte transgener Pflanzen mit dem iaaM-Gen unter dem Def-Gen-Promotor (ein Gen, das nur in Früchten exprimiert wird) parthenokarp sind, also ohne Bestäubung gebildet werden. Parthenokarpische Früchte zeichnen sich durch entweder das völlige Fehlen von Samen oder eine sehr geringe Anzahl davon aus, wodurch das Problem der „zusätzlichen Samen“ beispielsweise bei Wassermelonen, Zitrusfrüchten usw. gelöst werden kann. Es wurden bereits transgene Kürbispflanzen gewonnen, die sich im Allgemeinen nicht von den Kontrollpflanzen unterscheiden, aber praktisch keine Samen enthalten.

Das entwaffnete, onkogene Ti-Plasmid wird von Wissenschaftlern aktiv genutzt, um Mutationen zu erhalten. Diese Methode wird T-DNA-Insertionsmutagenese genannt. T-DNA, die sich in das Pflanzengenom integriert, schaltet das Gen, in das sie integriert ist, aus, und bei Funktionsverlust können Mutanten leicht selektiert werden (das Phänomen der Stummschaltung – Stummschaltung von Genen). Das Besondere an dieser Methode ist auch, dass Sie das entsprechende Gen sofort erkennen und klonen können. Derzeit wurden auf diese Weise viele neue Pflanzenmutationen gewonnen und die entsprechenden Gene geklont. MA Ramenskaya erhielt anhand der T-DNA-Mutagenese Tomatenpflanzen mit unspezifischer Resistenz gegen Kraut- und Knollenfäule. Nicht weniger interessant ist ein weiterer Aspekt der Arbeit: Es wurden transgene Pflanzen mit veränderten dekorativen Eigenschaften erhalten. Ein Beispiel ist die Produktion von Petunienpflanzen mit mehrfarbigen Blüten. Als nächstes folgen blaue Rosen mit einem aus einem Rittersporn geklonten Gen, das die Synthese des blauen Pigments steuert. Probleme der biologischen Sicherheit transgener Pflanzen

Einer der Haupteinwände gegen die Verwendung „transgener“ Lebensmittel ist das Vorhandensein von Antibiotikaresistenzgenen (insbesondere gegen Kanamycin) in vielen von ihnen, die im ursprünglichen DNA-Konstrukt als selektiv enthalten waren.

Es wird angenommen, dass diese Resistenzgene bei der Verdauung von Nahrungsmitteln auf körpereigene Mikroflora, darunter auch Krankheitserreger, übertragen werden können, wodurch Mikroben gegen dieses Antibiotikum resistent werden können. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit eines solchen Ereignisses in der Realität vernachlässigbar – zahlreiche Experimente und Beobachtungen in der Natur zu einem solchen horizontalen Gentransfer haben bisher nur negative Ergebnisse geliefert.

Es darf nicht vergessen werden, dass die in Pflanzen eingeführten Resistenzgene nur für die Expression in eukaryotischen, nicht aber in bakteriellen Zellen „abgestimmt“ sind. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass diese selektiven Gene natürlichen Populationen von Mikroorganismen entnommen wurden, wo sie aufgrund des aktiven Einsatzes von Antibiotika in der medizinischen Praxis heute weit verbreitet sind. Daher ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Antibiotikaresistenzgen aus einem natürlichen Reservoir in die menschliche Mikroflora gelangt, ungleich größer als bei der Verwendung transgener Pflanzen. Angesichts der öffentlichen Meinung werden jedoch Ansätze entwickelt, um das Vorhandensein „verdächtiger“ Gene in kommerzialisierten transgenen Formen auszuschließen.

In den meisten Fällen werden Antibiotikaresistenz-Markergene mittlerweile durch Herbizidresistenzgene ersetzt. Zwar stößt der Einsatz von „herbiziden“ Genen auch auf Einwände, aber schon jetzt bei Umweltschützern. Für die selektive Eliminierung eines Markergens nach Erhalt der gewünschten transgenen Pflanze, wenn es tatsächlich nicht mehr benötigt wird, wurden mehrere Methoden vorgeschlagen.

Es scheint sehr vielversprechend, bei der Auswahl transgener Pflanzenformen selektive Gene durch Reportergene zu ersetzen oder alternative selektive Gene zu verwenden, beispielsweise Gene für die Synthese von Phytohormonen oder die Hydrolyse spezifischer Formen von Polysacchariden beim Züchten von Pflanzen in einem Kulturmedium. Somit wird auch diese virtuelle Gefahr, die mit Antibiotikaresistenzgenen einhergeht, bald nicht mehr bestehen.

Im Hinblick auf eine mögliche Toxizität oder Allergenität transgener Pflanzen gelten hier die gleichen strengen Maßstäbe wie bei traditionell gewonnenen neuen Kulturpflanzensorten oder neuartigen Lebensmitteln. Bei diesen Parametern sind keine besonderen Unterschiede zwischen transgenen und gewöhnlichen Pflanzen zu erwarten (mit Ausnahme der besseren bei der Blockierung der Synthese von Toxinen oder Allergenen), und in der Praxis werden sie in der Regel auch nicht beobachtet.

Das Problem möglicher Umweltschäden hat mehrere Aspekte. Erstens besteht die Sorge, dass herbizidtolerante Nutzpflanzen diese Gene durch interspezifische Bestäubung an eng verwandte Unkräuter weitergeben könnten, die sich zu unzerstörbaren Superunkräutern entwickeln könnten. Obwohl die Wahrscheinlichkeit einer solchen unerwünschten Entwicklung von Ereignissen für die meisten Kulturpflanzen sehr gering ist, entwickeln Gentechniker und Agrarwissenschaftler aktiv Ansätze, um eine solche Gefahr zu beseitigen. An dieser Stelle ist jedoch zu beachten, dass auch dieses Thema nicht neu ist, da eine Reihe von herbizidresistenten Sorten, die durch konventionelle Züchtung gewonnen werden, schon seit langem in der landwirtschaftlichen Praxis eingesetzt werden. Gleichzeitig hat der flächendeckende Einsatz solcher resistenten Sorten bisher keine ökologische Katastrophe verursacht.

Dennoch versucht man auch in diesem Fall, um etwaige Einwände transgener Pflanzen abzuwehren, beispielsweise nicht nur ein, sondern gleich mehrere Resistenzgene gegen verschiedene Herbizide in Pflanzen einzuführen. Die Übertragung mehrerer Gene auf Unkräuter ist deutlich unwahrscheinlicher als die eines einzelnen Gens. Darüber hinaus ermöglicht die Resistenz gegen mehrere Herbizide die Rotation verschiedener Herbizide bei der Behandlung von Nutzpflanzen, wodurch die Ausbreitung eines bestimmten Resistenzgens in Unkräutern verhindert wird.

Es wird auch vorgeschlagen, Resistenzgene nicht in das Kerngenom, sondern in das Chloroplastengenom einzuführen. Dadurch kann eine unerwünschte Gendrift durch Pollen verhindert werden, da Chloroplasten nur über die mütterliche Linie vererbt werden.

Eine weitere gentechnisch veränderte Möglichkeit, Unkräuter ohne den Einsatz von Herbizidresistenzgenen im Allgemeinen zu bekämpfen, ist die biotransgene Methode. Wir sprechen über den Einsatz von Kleintieren wie Kaninchen, um Unkraut auf den Feldern zu fressen. Um Kulturpflanzen vor dem Verzehr zu schützen, kann gleichzeitig ein Gen in sie eingeführt werden, das sie für ein bestimmtes Tier unattraktiv (Geruch, Geschmack) macht. Ein solcher biotransgener Ansatz würde die meisten aktuellen Einwände gegen transgene Nutzpflanzen sofort beseitigen.

Die damit verbundenen Umwelteinwände betreffen im Wesentlichen transgene Pflanzen mit eingebetteten „Insektizid“-Genen, von denen angenommen wird, dass sie bei Insektenschädlingen eine Massenresistenz hervorrufen können. Außerdem werden wirksame Möglichkeiten zur Verringerung dieser Gefahr vorgeschlagen, beispielsweise die Verwendung von Genen für verschiedene Toxine und/oder induzierbare Promotoren, die schnell aktiviert werden, wenn Insekten die Pflanze angreifen. Dieses Problem ist im Allgemeinen nicht neu, da viele der derzeit auf „Genebene“ eingesetzten Insektizide seit langem in Form einer reinen Substanz zum Besprühen von Nutzpflanzen eingesetzt werden.

Eine weitere unerwünschte Folge der Verwendung transgener Pflanzen mit Insektizidgenen besteht darin, dass der Pollen dieser Pflanzen auch für nützliche Insekten, die sich von den Pollen ernähren, giftig sein kann. Einige experimentelle Daten legen dies nahe. dass eine solche Gefahr tatsächlich besteht, obwohl es immer noch schwierig ist, über ihr mögliches Ausmaß zu sprechen. Allerdings wurden hier bereits adäquate gentechnische Lösungen vorgeschlagen und getestet, beispielsweise der Einsatz von Transgenese durch Chloroplasten-DNA oder Promotoren, die in Pollen nicht wirken.

Die Hoffnungen, die gesetzt werden in gentechnisch veränderte (GV) Pflanzen kann in zwei Hauptbereiche unterteilt werden:

1.Verbesserung der qualitativen Merkmale der Pflanzenproduktion.

2. Steigerung der Produktivität und Stabilität der Pflanzenproduktion durch Erhöhung der Widerstandsfähigkeit der Pflanzen gegenüber schädlichen Faktoren.

Die Schaffung gentechnisch veränderter Pflanzen erfolgt meist zur Lösung folgender spezifischer Probleme:

1) Um die Produktivität zu steigern, indem Folgendes erhöht wird:

a) Resistenz gegen Krankheitserreger;

b) Resistenz gegen Herbizide;

c) Beständigkeit gegen widrige Temperaturen und Böden von geringer Qualität;

d) Verbesserung der Produktivitätseigenschaften (Geschmack und Nährwert, optimaler Stoffwechsel).

2) Für pharmakologische Zwecke:

a) Gewinnung von Arzneimittelherstellern;

b) Antigenproduzenten, die eine „passive“ Immunisierung von Nahrungsmitteln gewährleisten.

Die Hauptaufgaben der DNA-Technologie bei der Schaffung gentechnisch veränderter Pflanzen unter modernen Entwicklungsbedingungen von Landwirtschaft und Gesellschaft sind sehr vielfältig und lauten wie folgt:

1. Gewinnung von Hybriden (Kompatibilität, männliche Sterilität).

2. Optimierung des Pflanzenwachstums und der Pflanzenentwicklung (Änderungen im Pflanzenhabitus – zum Beispiel Höhe, Form der Blätter und des Wurzelsystems usw.; Veränderungen in der Blüte – zum Beispiel Struktur und Farbe der Blüten, Blütezeit).

3. Optimierung der Pflanzenernährung (Fixierung von Luftstickstoff durch Nicht-Leguminosenpflanzen; verbesserte Aufnahme mineralischer Nährstoffe; erhöhte Effizienz der Photosynthese).

4. Verbesserung der Produktqualität (Änderung der Zusammensetzung und/oder Menge an Fetten; Änderung des Geschmacks und Geruchs von Lebensmitteln; Gewinnung neuer Arten von medizinischen Rohstoffen; Änderung der Eigenschaften von Fasern für textile Rohstoffe; Änderung der Qualität und des Reifezeitpunkts oder Lagerung von Früchten).

5. Erhöhung der Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren (Trockenheits- und Salztoleranz. Hitzeresistenz; Überschwemmungsresistenz; Kälteanpassung; Resistenz gegen Herbizide; Resistenz gegen Bodensäure und Aluminium; Resistenz gegen Schwermetalle).

6. Erhöhung der Resistenz gegen biotische Stressfaktoren (Resistenz gegen Schädlinge, Resistenz gegen bakterielle, virale und Pilzkrankheiten).

Unter den Herbizidresistenzgenen wurden bereits Gene für die Resistenz gegen Herbizide wie Glyphosat (Roundup) geklont. Phosphinothricin (Bialafos), Ammoniumglyphosat (Basta), Sulfonylharnstoff und Imidozolin-Medikamente. Unter Verwendung dieser Gene wurden bereits transgene Sojabohnen, Mais, Baumwolle usw. gewonnen. Auch transgene Pflanzen, die gegen Herbizide resistent sind, werden in Russland getestet. Das Bioengineering Center hat eine gegen Basta resistente Kartoffelsorte entwickelt, die derzeit im Feldversuch getestet wird.

n Die Gesamtanbaufläche gentechnisch veränderter (GV) transgener Pflanzen belief sich im Jahr 2004 weltweit auf 81 Millionen Hektar

n Grundsätzlich handelt es sich dabei um gentechnisch veränderte Pflanzen im Hinblick auf die Resistenz gegen Krankheitserreger und Herbizide

Diese Studien tragen zur Entwicklung neuer Ansätze in der Landwirtschaft bei – zur Diagnose von Krankheiten, zur Identifizierung genetischer Merkmale von Rassen und Sorten für die Züchtung von Tieren und Pflanzen mit neuen verbesserten Eigenschaften auf der Grundlage gezielter Veränderungen im Genom. Bei modernen DNA-Technologien in Tieren und Pflanzen lassen sich drei Hauptbereiche unterscheiden:

1) DNA – Technologien zur Steuerung des Flusses von genetischem Material (Auswahl mithilfe molekulargenetischer Marker – MAS, zu diesem Zweck – Kartierung, Markierung der Hauptgene quantitativer Merkmale – QTL); Erhaltung der Biodiversität mithilfe molekulargenetischer Marker; Entwicklung genetisch fundierter Zuchtprogramme und Auswahl elterlicher Organismenformen unter Berücksichtigung der Daten der ökologischen Genetik.

2) DNA-Technologien zur Schaffung neuer Organismenformen zur Gewinnung von „Bioreaktoren“ (Produzenten therapeutisch wichtiger Proteine für den Menschen), zur Untersuchung der genetischen Mechanismen der Entwicklung und Prävention verschiedener Krankheiten sowie für grundlegende Studien zur strukturellen und funktionellen Organisation von genetisches Material, intergene Interaktionen.

3) DNA-Technologie zur gezielten Produktion und Reproduktion gewünschter Genotypen – Einsatz embryonaler Stammzelllinien, gezielte Veränderung bestimmter Gene, Gewinnung eineiiger Zwillinge usw.

DNA-Ökologie. Eine Reihe umwelt- und agrarökologischer Probleme, bei deren Lösung große Hoffnungen auf die DNA-Technologie gesetzt werden, sind komplexer Natur. Dazu gehört das Problem der Verbesserung der Bodenfruchtbarkeit. Der Einsatz von Düngemitteln für diese Zwecke, hauptsächlich stickstoffhaltiger, führt aus zwei Gründen nicht zum gewünschten Effekt. Erstens erfolgt die chemische Synthese stickstoffhaltiger Düngemittel in einem energieintensiven und teuren Verfahren. Zweitens werden Düngemittel, um die erforderliche Konzentration im Boden zu erreichen, im Übermaß ausgebracht und in erheblichen Mengen ausgewaschen, was zu einer Verschmutzung der Gewässer und unerwünschten Umweltveränderungen in der Umwelt führt. In diesem Zusammenhang müssen DNA-Technologien Möglichkeiten entwickeln, das biologische System der Stickstofffixierung zu nutzen, um Nutzpflanzen mit Ammoniumsalzen zu versorgen. Zur Lösung dieses Problems gibt es mehrere Möglichkeiten: die Verwendung frei lebender stickstofffixierender Bakterien oder einer isolierten modifizierten Nitrogenase (ein Enzym, das die biologische Stickstofffixierung durchführt) bei der industriellen Produktion von Ammoniak; Steigerung der Effizienz natürlicher stickstofffixierender Symbiontenbakterien und Entwicklung neuer symbiotischer Assoziationen; Einführung von Stickstofffixierungsgenen (nif-Genen) in Kulturpflanzen .. und andere.

1. Vielversprechende Entwicklungen in der Gentechnik.

2. Was sind rekombinante DNA-Moleküle?

3. Was ist genetische Transformation in einer Pflanze?

4. Nennen Sie die wichtigsten Methoden der Pflanzengenetik.

5. Beschreiben Sie Möglichkeiten zur Erhöhung der biologischen Fixierung von Luftstickstoff.

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