Dictionary Elution Az elúció egy anyag (vírus) szilárd hordozóból történő kimosási módszere. A megjelenítési módszer egy módszer heterológ fehérjék/peptidek bemutatására vírusok, sejtek vagy sejtmentes tenyészetek felületén fehérjék vagy peptidek kiválasztására. a szükséges tulajdonságokkal Bioszenzor Bioszenzor - analitikai rendszer (biológiai anyag + konverter ), amely lehetővé teszi a vizsgált mintában lévő anyagok kimutatását és koncentrációjuk becslését Elúció Az eluálás egy anyag (vírus) szilárd hordozóból történő kimosási módszere. Megjelenítési módszer A megjelenítési módszer egy módszer heterológ fehérjék/peptidek bemutatására vírusok, sejtek vagy sejtmentes tenyészetek felületén a kívánt tulajdonságokkal rendelkező fehérjék vagy peptidek kiválasztásához Biosensor A Biosensor egy analitikai rendszer (biológiai anyag + konverter), amely lehetővé teszi kimutatni a vizsgált mintában lévő anyagokat és megbecsülni azok koncentrációját

Protein engineering 4 Módszerek és megközelítések összessége fehérjék tanulmányozására és új tulajdonságokkal rendelkező fehérjék előállítására FŐ FELADATOK Klónkönyvtár létrehozása nukleotid- és aminosavszekvenciákból Az aminosavak egyszeri szubsztitúcióinak a fehérje feltekeredésére és funkcióira gyakorolt ​​hatásának vizsgálata Módszerek kidolgozása a hatékony módosításra fehérjéket, hogy megadják nekik a szükséges tulajdonságokat Módszerek és megközelítések kidolgozása a szükséges tulajdonságokkal rendelkező fehérjék szűrésére és kiválasztására

Racionális tervezés Racionális tervezés A fehérje térbeli szerveződésének ismeretének igénye Az intra- és intermolekuláris kölcsönhatások ismeretének igénye A módszerek és berendezések tökéletlensége olyan irány, amely új fehérjék létrehozását célozza térbeli kialakításukkal de novo

A fehérjemolekulák irányított evolúciója olyan irány, amelynek célja új fehérjék létrehozása szelekcióval 1 véletlen aminosav szekvenciák könyvtárának beszerzésével 2 olyan polipeptid láncok kiválasztásával, amelyek legalább kis mértékben rendelkeznek a szükséges tulajdonságokkal 3 véletlen mutagenezis segítségével új fehérjék könyvtárának kinyerésével, a következő szelekciós körben, vagy új fehérjéket expresszáló, genetikailag módosított konstrukciók felhasználásával

Fehérjemolekulák irányított evolúciója (opciók) racionális újratervezés irányított mutagenezis segítségével specifikus aminosavak cseréje a fehérjefelületek enzimkezelésének aktív központjában mutációk segítségével a polipeptid lánc szakaszait megváltoztatják az egymáshoz közel lévő aminosavak közelében. a fehérjegömb felszínén, de egymástól jelentős távolságra helyezkednek el a polipeptidláncban

Meghatározott tulajdonságokkal rendelkező fehérjék szűrése és szelekciója véletlenszerű szűrés javított szűrési szelekció minden fehérjét megvizsgálunk a szükséges tulajdonságok megléte szempontjából; a fehérjék kiválasztása a könyvtárból véletlenszerűen történik, minden fehérjét megvizsgálunk a szükséges tulajdonságok megléte szempontjából; a fehérjék kiválasztása a könyvtárból véletlenszerűen történik; lehetséges, ha a könyvtárat alkotó objektumok fenotípusosan különböznek egymástól (például enzimaktivitás jelenlétében); feltételeket teremtenek a könyvtár azon komponenseinek szelektív megőrzéséhez, amelyek bizonyos tulajdonságok (fág, sejtmegjelenítés); feltételek teremtődnek a könyvtár komponenseinek szelektív megőrzéséhez; bizonyos tulajdonságokkal rendelkeznek (fág, sejtmegjelenítés) a kívánt tulajdonságokkal rendelkező fehérje kimutatása nagyszámú makromolekula között az eredményül kapott klónkönyvtár

Fág display A cél az idegen fehérjék megjelenítése a fág felszínén A módszert 1985-ben fejlesztették ki az M13 fonalas bakteriofágra. (a pIII és pVIII gének alkalmas célhelyek idegen cDNS fragmentum beépítésére) A cél az idegen fehérjék feltárása a fág felszínén A módszert 1985-ben fejlesztették ki az M13 fonalas bakteriofágra. (a pIII és a pVIII gének megfelelő célhelyek egy idegen cDNS-fragmens beillesztéséhez) hibrid gént hoznak létre, amely a célfehérje és az egyik fág burokfehérje kódoló szekvenciáiból áll a bakteriofág által; az E. coli a fág során megfertőződik A hibrid fehérjéket a fágrészecske tartalmazza

Fagmid Helper fág Fággenom E. coli fertőzés segítő fággal A plazmidkönyvtárral/fagemiddel transzformált E. coli sejteket helper fággal fertőzzük meg, hogy fágrészecskéket kapjunk, amelyek felületén a célfehérje különböző változatai láthatók E. plazmidkönyvtárral / fágmiddal transzformált coli sejteket egy segítő fággal fertőzik meg , hogy olyan fágrészecskéket kapjanak , amelyek felületén a célfehérje különböző változatai láthatók

A fehérjemérnökség gyakorlati alkalmazásának kilátásai Gyógyászat: *új gyógyszerek előállítására; diagnosztikai eszközök létrehozására és vakcinák előállítására; *az immunválasz mechanizmusainak, valamint az immunrendszer betegségeinek tanulmányozására Ökológia: *Biokatalizátorok kinyerésére teljes sejtek formájában, felületükön immobilizált enzimekkel; *diagnosztikai és környezeti monitoring célú bioszenzorok beszerzésére; *bio adszorbensek létrehozására a mérgező anyagok és nehézfém-ionok környezetből történő eltávolítására

Glükózmérés enzimelektróddal (L. Clark kísérletének sematikus ábrázolása). A glükóz oxidációja a glükóz-oxidáz enzim által oxigén jelenlétében: glükóz + O 2 H 2 O 2 + glükono-1,5-lakton. A H 2 O 2 a platinaelektródán +700 mV potenciálon redukálódik; az áramkörben folyó áram arányos a hidrogén-peroxid (azaz közvetve a glükóz) koncentrációjával.

Szókincs Immobilizálás Az immobilizáció a molekulák mobilitásának korlátozása és azok megerősítő átrendeződése. Aerotank Az Aerotank egy szennyvíztisztító rendszer, tározók, amelyekben az SW, a mikrobiális iszap és a levegő keveredik. anaerob körülmények között Bioremediáció A bioremediáció a víz, a talaj és a légkör tisztítására szolgáló módszerek összessége biológiai objektumok - növények, gombák, rovarok, férgek és más organizmusok - anyagcserepotenciáljának felhasználásával Immobilizáció Az immobilizáció a molekulák mobilitásának korlátozása és átrendeződésük megerősítése Aerotank Az Aerotank egy szennyvíztisztító rendszer, tározók, amelyekben az SW, a mikrobiális iszap és a levegő keveredik. Digester A Digester a szerves szennyező anyagok biológiai feldolgozására szolgáló tározó baktériumok felhasználásával anaerob körülmények között Bioremediáció A bioremediáció a víz, a talaj és a biológiai objektumok – növények, gombák, rovarok, férgek és más organizmusok – anyagcserepotenciálját felhasználva légkör

Az enzimek osztályozása Osztály Katalizált reakciók Példák enzimekre Oxidoreduktázok Reduktív és oxidatív reakciók Több mint 200 enzim ismert. Kataláz, glükóz-oxidáz Transzferázok Az atomcsoportok reverzibilis átvitele donoroktól akceptorokhoz. Több mint 450 enzim ismert. Piruvát kináz, protein kináz Hidrolázok Hidrolízis reakciók Több mint 200 hidroláz ismert. Proteáz, amiláz, celluláz Liázok Az atomcsoportok nem hidrolitikus lehasítása a szubsztrátról kettős kötések kialakítására Több mint 100 liáz ismert. Aszpartáz, fumaráz Izomerázok Szerves vegyületek átrendeződésének intramolekuláris reakciói Több mint 50 enzim ismert. Glükóz-imeráz Ligázok Két különböző molekula egymáshoz kapcsolódásának reakciói Több mint 100 ismert. DNS ligáz, triptofán szintetáz

Mikroorganizmusok Enzimforrások A bacillusok ribonukleázok, dezoxiribonukleázok és proteázok, valamint élesztőgombák bioszintetizálói - glükoamilázok, invertázok és savas foszfatáz növények. a foszfatázt a gyomorból izolálják. A sertés gyomrából pepszint állítanak elő, a szarvasmarha szívéből a laktát-dehidrogenázt, a gyomorból az alkalikus foszfatázt izolálják. A sertés gyomrát pepszin előállítására használják

Immobilizációs módszerek Fizikai módszerek Kémiai módszerek adszorpció oldhatatlan hordozón, gél pórusaiba zárás, térbeli elválasztás féligáteresztő membrán segítségével és egyebek új kovalens kötések létrehozásán alapulnak az enzim és a hordozó között

Az immobilizált enzimek előnyei az enzimek elválasztása a reakcióközegből, a reakció megfelelő időben történő leállítása és az enzimmel nem szennyezett termék előállítása; folytonos üzemmódban hajtsa végre a folyamatot és szabályozza a reakciósebességet; megváltoztatja a katalizátor tulajdonságait, specifitását, a reakciókörülményektől való függést és a denaturáló hatásokra való érzékenységet; szabályozzák az enzim katalitikus aktivitását a hordozó befolyásolásával

Enzimek a biotechnológiai termelésben Enzimforrás, immobilizálási módszer Biotechnológia Acetil-neutraminát -9-foszfát szintáz Enzim E. coli. Poliakrilamid gélbe való beépítés. Sziálsavak szintézise. Tormából származó peroxidáz enzim. Kopolimerizáció és alginát bevitele a gélbe. A fenol oxidációja a szennyvízben. 3-Ketoszteroid-dehidrogenáz Mycobacterium globiformis sejtek. Poliakrilamid gélbe való beépítés. A hidrokortizon átalakulása prednizolonná

Lavryashina M.B. KemSU Környezeti biotechnológia módszerei Biológiai szennyvíztisztítás Bio(fito)remediáció Biobiztonságos rovarirtók és gyomirtó szerek létrehozása Biobiztonságos rovarirtók és gyomirtó szerek előállítása Környezetbarát energia előállítása Betegségálló mezőgazdasági növények létrehozása Fémek bakteriális kilúgozása Veszélyeztetett és kihalt állatfajok klónozása

A szennyvíztisztítás módszerei Mechanikai (ülepítés, szűrés) Mechanikai Kémiai (reagensekkel való érintkezés) Kémiai Fizikai-kémiai Biológiai (biokémiai öntisztulás)) Biológiai A biotechnológia legfontosabb problémája a szennyvíztisztítás.

Az aerotankok homogenizátorral, ülepítő tartályokkal, iszapregenerátorral és iszaptömörítővel (préselővel) együtt működnek. Aerotank Aerotank (aero és angol tank tankból, tank) ülepítő tartály homogenizátor AEROTENK iszapregenerátor prés tisztított szennyvíz eleveniszapos szennyvíz rothasztó

Digeszter Digeszter (metánból és angol tartályból - tartály, tartály) Baktériumcsoportok Kiindulási anyagok Termékek HIDROLITIKUS ACETOGÉN Szerves szennyezők Magasabb zsírsavak HIDROGÉNTERMELŐ Magasabb zsírsavak H 2, CO 2, CH 3 COOH METÁNKÉPZŐ H 2, CO 2, CH 3 COOH CH 4, CO 2

A metános fermentáció fázisai 1 polimerek biohidrolízise és acidogenezis (a szerves anyagok magasabb zsírsavakká, acetáttá és hidrogénné alakulnak) 2 acetogenezis és dehidrogénezés (a magasabb zsírsavakból acetát és hidrogén keletkezik) 3 Metanogenezis (metán, hidrogén és szén-dioxid keletkezik acetátból)

I. fázis. CELLULÓZRONTÓ (Bacterioides ruminicola, Butyrivibrio fibriosolvens) PROTEOLITIKUS PROTEOLITIKUS (Clostridium, Petrococcus) Fázis II. ACETOGÉN (Syntrophobacter wolinii) III fázis. MÉTÁNKÉPZÉS (Metanobacterium thermoautotrophicum, Metanococcus vannielii) Példák mikroorganizmusokra

BIOREMEDIÁCIÓ A módszer a mikroorganizmusok azon képességén alapul, hogy összetett szerves anyagokat hasznosítanak, és azok egyszerű „biológiailag biztonságos” anyagokká bomlanak le Molekuláris biológia és genetika Ökológia Mérnöki tudományok Mikrobiológia BIOREMEDIÁCIÓ

Bioremediáció. Megközelít. Természetes „vad” mikroorganizmusok aktivitásának felhasználása Természetes „vad” mikroorganizmusok aktivitásának felhasználása (intenzifikátor szükséges, pl. O 2) Aktív törzsek felhasználása biológiai termékek formájában intenzív szennyezett helyekre

Szennyezett területek biodiverzitásának vizsgálata Az eltávolított szennyezőanyagok elpusztítására képes mikroflóra izolálása A lokális mikroflóra aktiválása (biostimuláció). Speciális mikroorganizmusok-destruktorok bejuttatása szennyezett területekre (bioremediáció) Bioremediáció. Szakasz.

SZENNYEZÉS Kémiai elemzés Mérnöki technológiák Biostimuláció (Természetes mikrobiális közösségek) Biostimuláció Bioremediáció (Mesterséges mikrobiális biológiai termékek) Bioremediáció Bioremediáció monitorozás Biofitoremediáció (Növény- és mikroorganizmusközösségek) Biofitoremediáció

Rovarkártevőkkel szemben rezisztens transzgenikus növények építése 1. SPECIFIKUS TOXINOK SZINTÉZISE 2. ROVARLÁRVÁK SEJFALAJRA HATÓ HIDROLITIKUS ENZIMEK SZINTÉZISE 3. PROTEINÁZ INHIBITOROK ÉS A NÖVÉNYI POLIZZACHARIDOKAT TÖRŐ ENZIM INHIBITOROK SZINTÉZISE 4. A NÖVÉNYEK SZEKunder metabolizmusának MÓDOSÍTÁSA: A) A SZÜKSÉGES ANYAGOK KORLÁTOZÁSA RA SZÜKSÉGES ANYAGOK SZÜKSÉGESESZULJÁBAN. VÉDELMI VÁLASZ: A) SZÖVET-SPECIFIKUS KIFEJEZÉS A GÉN B) A GÉNKIFEJEZÉS SZABÁLYOZÁSA KÜLÖNBÖZŐ TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES TÉNYEZŐK ÁLTAL Transzgénikus növények fokozott rezisztenciája a gombakórokozóval szemben Phomopsis helianhi Transzgenikus növények fokozott rezisztenciája a gombakórokozóval szemben Phomopsis helianhi A B - nem transzgén növény A B - nem transzgén növény transzgenikus növény B - transzgenikus növény

A tesztben szereplő témák hozzávetőleges listája az 1. teszthez. Biotechnológia története. A történelmi korszakok jellemzői. A legjelentősebb felfedezések, amelyek fontos szerepet játszottak a tudomány fejlődésében. 2. A biotechnológia általános fogalmai: biotechnológiai rendszer, biotechnológiai folyamat, biotechnológiai tárgy. 3. Biotechnológiai objektumok, meghatározás, a biológiai objektum biotechnológiai rendszerben elfoglalt helyének jellemzői, osztályozás, gyakorlati alkalmazási példák. 4. Mikroorganizmusok, mint biológiai objektumok. Példák, gyakorlati felhasználás a biotechnológiában. 5. Sejt- és szövettenyészetek, mint biológiai objektumok. Példák, gyakorlati felhasználás a biotechnológiában. 6. Biotechnológiai folyamat. Szakasz. A biotechnológiai folyamat szakaszainak rövid leírása. 7. A mikroorganizmusok, mint szelekciós objektumok jellemzői. Mikroorganizmusok kiválasztása a biotechnológiában. 8. Mutagenezis: meghatározása, a mutagenezis formái, mutagén tényezők. 9. A szelekció során keletkezett mutáns mikroorganizmusok szelekciója a biotechnológiai folyamat előkészítő szakaszában. 10. Biológiai objektumok kiválasztása. Szakaszok, megközelítések, módszerek.

11. Géntechnológia: cél, technológia, biológiai objektumok, gyakorlati alkalmazási példák, modern vívmányok. 12. Génsebészeti enzimek. A katalizált reakciók osztályozása, jellemzői. 13. Módszerek génszerzésre a géntechnológiában. A módszerek rövid leírása, előnyei és hátrányai. 14. Vektorok a géntechnológiában. A vektorok definíciója, osztályozása, követelményei, rövid jellemzői. 15. Rekombináns DNS. A rekombináns DNS kinyerésének meghatározása, célja, módszerei a génsebészetben. 16. Módszerek rekombináns DNS bejuttatására recipiens sejtbe és módosított sejtek szelekciója a géntechnológiában. 17. Növények transzgenezise. Vektor. Alapvető stratégiák. Módszerek transzgének bejuttatására és transzgenikus szervezetek kiválasztására. 18. Állati transzgenezis. Vektor. Alapvető stratégiák. Módszerek transzgének bejuttatására és transzgenikus szervezetek kiválasztására. 19. Sejttechnika: cél, technológia, biológiai objektumok, gyakorlati alkalmazási példák, modern vívmányok. 20. Növényi sejtek és szövetek tenyésztésének módszerei. Növényi kultúrák tenyésztési körülményei, osztályozása és rövid jellemzői a sejttervezésben

21. Szomatikus növényhibridek. Gyártási technika, modern vívmányok, gyakorlati alkalmazási példák. 22. Protoplasztok: meghatározás, felhasználás a sejttervezésben, a protoplasztok izolálásának módszerei és feltételei. 23. Protoplasztok tenyésztése és fúziója a sejttervezésben. Módszerek, feltételek, fuzogének. 24. Sejt- és növényi szövettenyészetek gyakorlati alkalmazása. Bioszintézis és biotranszformáció, mikroszaporítás, példák értékes tulajdonságokkal rendelkező transzgenikus növényekre. 25. Állatsejt-mérnökség. Módszerek, tárgyak, technológia, modern vívmányok, gyakorlati alkalmazás. 26. Állati sejt- és szövettenyészetek. Kultúrák osztályozása, termesztési körülmények, táptalajok, szomatikus hibridek előállítási módjai, gyakorlati alkalmazása. 27. Őssejtek. Jellegzetes. Osztályozás. Pályázati kilátások. 28. Klónozás. A módszer jellemzői. Osztályozás. Pályázati kilátások. 29. Biotechnológiai folyamat. Termesztési szakasz. A mikroorganizmusok, növényi és állati sejtek tápközegeinek főbb szakaszai, jellemzői. Felszerelés. 30. Biotechnológiai folyamat. Termesztési szakasz. Biológiai objektumok termesztési módjai. A tenyészet növekedésének szakaszai bioreaktorban, a céltermék szintézise.

31. Biotechnológiai folyamat. Termék átvételi szakasz. Biotechnológiai termék elválasztásának és tisztításának főbb szakaszai és módszerei. Példák biotechnológiai termékekre. 32. Környezeti biotechnológia: cél, módszerek, biológiai objektumok, gyakorlati alkalmazási példák, modern vívmányok. 33. Környezeti biotechnológia. Ivóvíz probléma. A szennyvíztisztítás aerob módszerei. 34. Környezeti biotechnológia. Ivóvíz probléma. A szennyvíztisztítás anaerob módszerei. 35. Környezeti biotechnológia. Bioremediáció, biofitoremediáció. 36. Biotechnológia: a biotechnológia célja, tárgya, célkitűzései, főbb irányai. Modern vívmányok a biotechnológia területén. 37. Mérnöki enzimológia. Cél, problémák. Kilátások. Az enzimek forrásai. 38. Immobilizált enzimek. Az immobilizálás előnyei, módszerei. 39. Immobilizált enzimek. Hordozók immobilizáláshoz, gyakorlati használatra. 40. Protein engineering. Irányok, módszerek, kilátások.

A fehérjetechnológia a biotechnológia egyik ága, amely hasznos vagy értékes fehérjék kifejlesztésével foglalkozik. Ez egy viszonylag új tudományág, amely a fehérje hajtogatás tanulmányozására, valamint a fehérje módosításának és létrehozásának elveire összpontosít.

A fehérje-manipulációnak két fő stratégiája van: az irányított fehérjemódosítás és az irányított evolúció. Ezek a módszerek nem zárják ki egymást; a kutatók gyakran mindkettőt használják. A jövőben a fehérjék szerkezetének és működésének részletesebb ismerete, valamint a csúcstechnológia fejlődése jelentősen bővítheti a fehérjemérnökség lehetőségeit. Ennek eredményeként a nem természetes aminosavak is beépülhetnek egy új módszernek köszönhetően, amely lehetővé teszi új aminosavak beépülését a genetikai kódba.

A fehérjetechnológia a fehérjefizika és a kémia és a géntechnológia metszéspontjából származik. Megoldja a meghatározott tulajdonságokkal rendelkező módosított vagy hibrid fehérjemolekulák létrehozásának problémáját. Egy ilyen feladat megvalósításának természetes módja a megváltozott fehérjét kódoló gén szerkezetének előrejelzése, szintézisének, klónozásának és expressziójának végrehajtása a recipiens sejtekben.

Az első szabályozott fehérjemódosítást a 60-as évek közepén végezte Koshland és Bender. A hidroxilcsoport szulfhidrilcsoporttal való helyettesítésére a proteáz aktív centrumában, a szubtilizinben kémiai módosítási módszert alkalmaztak. Azonban, mint kiderült, az ilyen tiolszubtilizin nem tartja meg a proteázaktivitást.

Kémiailag a fehérje egyetlen típusú molekula, amely poliaminosavlánc vagy polimer. 20 típusú aminosav szekvenciából áll. A fehérjék szerkezetének megismerése után az emberek feltették a kérdést: lehetséges-e teljesen új aminosav-szekvenciákat úgy tervezni, hogy azok sokkal jobban ellátják azokat a funkciókat, amelyekre az embernek szüksége van, mint a közönséges fehérjék? A Protein Engineering név megfelelő volt ehhez az ötlethez.

Az emberek a 20. század 50-es éveiben kezdtek gondolkodni az ilyen mérnöki munkákon. Ez közvetlenül az első fehérje aminosavszekvenciák megfejtése után történt. A világ számos laboratóriumában kísérleteket tettek a természet megkettőzésére és adott abszolút tetszőleges poliaminosavszekvenciák kémiai szintézisére.

Ez B. Merrifield vegyésznek sikerült a legjobban. Ennek az amerikainak sikerült rendkívül hatékony módszert kidolgoznia poliaminosavláncok szintézisére. Merrifield ezért 1984-ben kémiai Nobel-díjat kapott.

1. ábra. A fehérje mérnöki működésének vázlata.

Az amerikai elkezdett rövid peptideket szintetizálni, beleértve a hormonokat is. Ezzel egy időben épített egy automatát - egy „vegyi robotot” -, amelynek feladata mesterséges fehérjék előállítása volt. A robot szenzációt keltett tudományos körökben. Hamar kiderült azonban, hogy termékei nem versenyezhetnek azzal, amit a természet termel.

A robot nem tudta pontosan reprodukálni az aminosav-szekvenciákat, vagyis hibázott. Az egyik láncot egy szekvenciával, a másikat egy kissé módosított szekvenciával szintetizálta. Egy sejtben egy fehérje minden molekulája ideálisan hasonlít egymáshoz, vagyis szekvenciájuk abszolút azonos.

Volt még egy probléma. Még azok a molekulák sem vették fel az enzim működéséhez szükséges térbeli formát, amelyeket a robot megfelelően szintetizált. Így az a kísérlet, hogy a természetet a szerves kémia szokásos módszereivel helyettesítsék, igen szerény sikerre vezetett.

A tudósok csak a természettől tanulhattak, keresve a fehérjék szükséges módosításait. Itt az a lényeg, hogy a természetben folyamatosan vannak olyan mutációk, amelyek a fehérjék aminosav-szekvenciájának megváltozásához vezetnek. Ha kiválasztja a szükséges tulajdonságokkal rendelkező mutánsokat, amelyek egy adott szubsztrátot hatékonyabban dolgoznak fel, akkor egy ilyen mutánsból izolálhat egy megváltozott enzimet, amelynek köszönhetően a sejt új tulajdonságokat szerez. De ez a folyamat nagyon hosszú ideig tart.

Minden megváltozott, amikor megjelent a génsebészet. Hála neki, elkezdtek mesterséges géneket létrehozni bármilyen nukleotidszekvenciával. Ezeket a géneket előkészített vektormolekulákba inszertáltuk, és a DNS-t baktériumokba vagy élesztőbe juttattuk. Ott a mesterséges génből RNS másolatot vettek ki. Ennek eredményeként a szükséges fehérje termelődik. A szintézis hibáit kizártuk. A lényeg a megfelelő DNS-szekvencia kiválasztása volt, majd maga a sejt enzimrendszere is hibátlanul végezte a dolgát. Így arra a következtetésre juthatunk, hogy a génsebészet megnyitotta az utat a fehérjesebészet legradikálisabb formájában.

Protein Engineering stratégiák

Célzott fehérjemódosítás. A célzott fehérjemódosítás során a tudós a fehérje szerkezetének és funkciójának részletes ismeretét használja fel a kívánt változtatások elvégzéséhez. Általában ennek a módszernek az az előnye, hogy olcsó és technikailag egyszerű, mivel a helyspecifikus mutagenezis technikája jól fejlett. Legfőbb hátránya azonban, hogy egy-egy fehérje részletes szerkezetére vonatkozó információk gyakran hiányoznak, sőt, ha a szerkezet ismert, nagyon nehéz megjósolni a különböző mutációk hatását.

A fehérjemódosító szoftveralgoritmusok olyan új aminosavszekvenciák azonosítására törekszenek, amelyek kis energiát igényelnek egy előre meghatározott célstruktúra kialakításához. Míg a megtalálandó szekvencia nagy, a fehérjemódosítás legnehezebb követelménye az optimális szekvencia azonosításának és meghatározásának gyors, mégis pontos módja, szemben a hasonló szuboptimális szekvenciákkal.

Irányított evolúció. Az irányított evolúció során véletlenszerű mutagenezist alkalmaznak egy fehérjére, és kiválasztják azokat a változatokat, amelyek bizonyos tulajdonságokkal rendelkeznek. Ezután több mutációs és szelekciós kört alkalmaznak. Ez a módszer a természetes evolúciót utánozza, és általában kiváló eredményeket ad az irányított módosításhoz.

A DNS-keverés néven ismert további technika a sikeres variánsok egyes részeit összekeveri és azonosítja a jobb eredmények elérése érdekében. Ez a folyamat utánozza az ivaros szaporodás során természetesen előforduló rekombinációkat. Az irányított evolúció előnye, hogy nem igényel előzetes fehérjeszerkezeti ismereteket, és nem szükséges előre megjósolni, hogy egy adott mutáció milyen hatással lesz. Az irányított evolúciós kísérletek eredményei valóban meglepőek, mert a kívánt változásokat gyakran olyan mutációk okozzák, amelyeknek nem kellene ilyen hatást kifejteniük. Hátránya, hogy ez a módszer nagy áteresztőképességet igényel, ami nem minden fehérje esetében lehetséges. Nagy mennyiségű rekombináns DNS-t kell mutálni, és a termékeket a kívánt minőségre szűrni kell. A rengeteg lehetőség gyakran megköveteli a robotika vásárlását a folyamat automatizálásához. Ráadásul nem mindig könnyű minden érdeklődésre számot tartó tulajdonságot kiszűrni.

Tanfolyami munka

tudományág: Mezőgazdasági biotechnológia

a következő témában: „Fehérje-mérnökség”

Bevezetés. Protein engineering

2 Fehérje mérnöki stratégiák. Példák mesterséges fehérjékre. A Protein Engineering alkalmazásai

1 Peptid és epitóp könyvtárak

2 Riporterfehérjék fúziós fehérjékben

3 A fehérjetechnológia néhány vívmánya.

Következtetés

Bibliográfia

Esszé

Téma: Protein engineering.

Kulcsszavak: biotechnológia, géntechnológia, fehérje, genetikai kód, gén, DNS, RNS, ATP, peptidek, epitóp.

A tantárgyi munka célja: a „protein engineering” fogalmának és felhasználási lehetőségeinek tanulmányozása.

A fehérjefejlesztés lehetséges lehetőségei:

Az átalakítandó anyag - a szubsztrát - enzimhez való kötődési erősségének változtatásával növelhető az enzimreakció általános katalitikus hatékonysága.

A fehérje stabilitásának széles hőmérséklet- és savassági tartományban történő növelésével olyan körülmények között használható, amelyek mellett az eredeti fehérje denaturálódik és elveszti aktivitását.

Azáltal, hogy olyan fehérjéket hozunk létre, amelyek vízmentes oldószerekben képesek működni, lehetővé válik a katalitikus reakciók nem fiziológiás körülmények között történő végrehajtása.

Egy enzim katalitikus centrumának megváltoztatásával növelhető az enzim specifitása és csökkenthető a nem kívánt mellékreakciók száma

A fehérje rezisztenciájának növelésével az azt lebontó enzimekkel szemben a tisztítási eljárás leegyszerűsíthető.

Egy fehérjét úgy módosítva, hogy az a szokásos nem aminosav komponense (vitamin, fématom stb.) nélkül tudjon működni, felhasználható néhány folyamatos technológiai folyamatban.

Az enzim szabályozó régióinak szerkezetének megváltoztatásával a negatív visszacsatolás típusának megfelelően csökkenthető az enzimreakció terméke általi gátlásának mértéke, és ezáltal növelhető a termék hozama.

Lehetőség van olyan hibrid fehérje létrehozására, amely kettő vagy több fehérje funkcióját tölti be.

Lehetőség van olyan hibrid fehérje létrehozására, amelynek egyik szakasza elősegíti a hibrid fehérje felszabadulását a tenyésztett sejtből, illetve a keverékből való extrahálását.

Bevezetés

A biotechnológiát ősidők óta főleg az élelmiszeriparban és a könnyűiparban alkalmazták: borászatban, pékségben, tejtermékek erjesztésében, len- és bőrfeldolgozásban, mikroorganizmusok felhasználásán alapulva. Az elmúlt évtizedekben a biotechnológia lehetőségei rendkívüli mértékben bővültek. Ennek az az oka, hogy módszerei jövedelmezőbbek a hagyományosnál azon egyszerű oknál fogva, hogy az élő szervezetekben az enzimek által katalizált biokémiai reakciók optimális körülmények között (hőmérséklet és nyomás) mennek végbe, termelékenyebbek, környezetbarátabbak és nem igényelnek vegyszert. reagensek, amelyek mérgezik a környezetet.

A biotechnológia tárgyai az élő szervezetek csoportjainak számos képviselője - mikroorganizmusok (vírusok, baktériumok, protozoonok, élesztők), növények, állatok, valamint a belőlük izolált sejtek és szubcelluláris komponensek (organellumok), sőt enzimek is. A biotechnológia az élő rendszerekben végbemenő fiziológiai és biokémiai folyamatokon alapul, amelyek energia felszabadulását, anyagcseretermékek szintézisét és lebontását, valamint a sejt kémiai és szerkezeti összetevőinek kialakulását eredményezik.

A biotechnológia fő iránya mikroorganizmusok és tenyésztett eukarióta sejtek felhasználásával biológiailag aktív vegyületek (enzimek, vitaminok, hormonok), gyógyszerek (antibiotikumok, vakcinák, szérumok, erősen specifikus antitestek stb.), valamint értékes vegyületek előállítása. takarmány-adalékanyagok, például esszenciális aminosavak, takarmányfehérjék stb.).

A géntechnológiai módszerek lehetővé tették az emberi genetikai betegségek kezeléséhez szükséges hormonok, például inzulin és szomatotropin (növekedési hormon) ipari mennyiségben történő szintetizálását.

A biotechnológia nemcsak a tudomány és a termelés sajátos problémáit oldja meg. Globálisabb módszertani feladata van - kiterjeszti és felgyorsítja az élő természetre gyakorolt ​​emberi hatás mértékét, és elősegíti az élő rendszerek alkalmazkodását az emberi lét feltételeihez, azaz a nooszférához. A biotechnológia tehát az antropogén adaptív evolúció erőteljes tényezőjeként működik.

A biotechnológia, a géntechnológia és a sejttechnológia ígéretes kilátásokkal rendelkezik. Ahogy egyre több új vektor jelenik meg, az emberek ezek segítségével juttatják be a szükséges géneket a növények, állatok és emberek sejtjébe. Ez lehetővé teszi számos örökletes emberi betegségtől való fokozatos megszabadulást, rákényszeríti a sejteket a szükséges gyógyszerek és biológiailag aktív vegyületek, majd közvetlenül az élelmiszerekben használt fehérjék és esszenciális aminosavak szintetizálására. A természet által már elsajátított módszerekkel a biotechnológusok azt remélik, hogy fotoszintézis útján hidrogént nyerhetnek – a jövő legkörnyezetbarátabb üzemanyagát, az elektromosságot, és a légköri nitrogént normál körülmények között ammóniává alakítják.

A természetes fehérjék fizikai és kémiai tulajdonságai gyakran nem felelnek meg azoknak a feltételeknek, amelyek között ezeket a fehérjéket az ember felhasználja. Elsődleges szerkezetének megváltoztatása szükséges, amely biztosítja a korábbitól eltérő térszerkezetű, új fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkező fehérje kialakulását, amely lehetővé teszi, hogy más körülmények között is elláthassa a természetes fehérjében rejlő funkciókat. A fehérjetechnológia fehérjék felépítésével foglalkozik.

A fehérjetechnológia másik alkalmazási területe olyan fehérjék létrehozása, amelyek semlegesíthetik a kémiai és biológiai támadásokhoz használható anyagokat és mikroorganizmusokat. Például a hidroláz enzimek képesek semlegesíteni az ideggázokat és a mezőgazdaságban használt peszticideket. Ráadásul az enzimek előállítása, tárolása és felhasználása nem veszélyes a környezetre és az emberi egészségre.

A megváltozott fehérje előállításához kombinatorikus kémiai módszereket alkalmaznak, és irányított mutagenezist hajtanak végre - specifikus változásokat vezetnek be a DNS kódoló szekvenciáiban, ami bizonyos változásokhoz vezet az aminosavszekvenciákban. A kívánt tulajdonságokkal rendelkező fehérje hatékony megtervezéséhez ismerni kell a fehérje térszerkezetének kialakulási mintázatait, amelyektől fizikai-kémiai tulajdonságai és funkciói függenek, vagyis ismerni kell a fehérje elsődleges szerkezetét. , minden aminosav-maradéka befolyásolja a fehérje tulajdonságait és funkcióit. Sajnos a legtöbb fehérje harmadlagos szerkezete ismeretlen, nem mindig ismert, hogy melyik aminosavat vagy aminosav-szekvenciát kell megváltoztatni, hogy a kívánt tulajdonságokkal rendelkező fehérjét kapjuk. A számítógépes elemzést használó tudósok már most megjósolhatják számos fehérje tulajdonságait az aminosavak szekvenciája alapján. Egy ilyen elemzés nagymértékben leegyszerűsíti a kívánt fehérjék létrehozásának folyamatát. Mindeközben a kívánt tulajdonságokkal rendelkező módosított fehérje előállítása érdekében főként más úton haladnak: több mutáns gént is beszereznek, és ezek közül megtalálják a kívánt tulajdonságokkal rendelkező fehérjeterméket.

Különféle kísérleti megközelítéseket alkalmaznak a helyspecifikus mutagenezishez. Miután megkapta a módosított gént, beépül egy genetikai konstrukcióba, és bekerül a prokarióta vagy eukarióta sejtekbe, amelyek szintetizálják az e genetikai konstrukció által kódolt fehérjét.

I. Protein engineering

.1 A fehérjetechnológia fogalma. Fejlődéstörténet

A fehérjetechnológia a biotechnológia egyik ága, amely hasznos vagy értékes fehérjék kifejlesztésével foglalkozik. Ez egy viszonylag új tudományág, amely a fehérje hajtogatás tanulmányozására, valamint a fehérje módosításának és létrehozásának elveire összpontosít.

A fehérje-manipulációnak két fő stratégiája van: az irányított fehérjemódosítás és az irányított evolúció. Ezek a módszerek nem zárják ki egymást; a kutatók gyakran mindkettőt használják. A jövőben a fehérjék szerkezetének és működésének részletesebb ismerete, valamint a csúcstechnológia fejlődése jelentősen bővítheti a fehérjemérnökség lehetőségeit. Ennek eredményeként a nem természetes aminosavak is beépülhetnek egy új módszernek köszönhetően, amely lehetővé teszi új aminosavak beépülését a genetikai kódba.

A fehérjetechnológia a fehérjefizika és a kémia és a géntechnológia metszéspontjából származik. Megoldja a meghatározott tulajdonságokkal rendelkező módosított vagy hibrid fehérjemolekulák létrehozásának problémáját. Egy ilyen feladat megvalósításának természetes módja a megváltozott fehérjét kódoló gén szerkezetének előrejelzése, szintézisének, klónozásának és expressziójának végrehajtása a recipiens sejtekben.

Az első szabályozott fehérjemódosítást a 60-as évek közepén végezte Koshland és Bender. A hidroxilcsoport szulfhidrilcsoporttal való helyettesítésére a proteáz aktív helyén, a szubtilizinben kémiai módosítási módszert alkalmaztak. Azonban, mint kiderült, az ilyen tiolszubtilizin nem tartja meg a proteázaktivitást.

Kémiailag a fehérje egyetlen típusú molekula, amely poliaminosavlánc vagy polimer. 20 típusú aminosav szekvenciából áll. A fehérjék szerkezetének megismerése után az emberek feltették a kérdést: lehetséges-e teljesen új aminosav-szekvenciákat úgy tervezni, hogy azok sokkal jobban ellátják azokat a funkciókat, amelyekre az embernek szüksége van, mint a közönséges fehérjék? A Protein Engineering név megfelelő volt ehhez az ötlethez.

Az emberek a 20. század 50-es éveiben kezdtek gondolkodni az ilyen mérnöki munkákon. Ez közvetlenül az első fehérje aminosavszekvenciák megfejtése után történt. A világ számos laboratóriumában kísérleteket tettek a természet megkettőzésére és adott abszolút tetszőleges poliaminosavszekvenciák kémiai szintézisére.

Ez B. Merrifield vegyésznek sikerült a legjobban. Ennek az amerikainak sikerült rendkívül hatékony módszert kidolgoznia poliaminosavláncok szintézisére. Merrifield ezért 1984-ben kémiai Nobel-díjat kapott.

1. ábra. A fehérje mérnöki működésének vázlata.

Az amerikai elkezdett rövid peptideket szintetizálni, beleértve a hormonokat is. Ezzel egy időben épített egy automatát - egy „vegyi robotot” -, amelynek feladata mesterséges fehérjék előállítása volt. A robot szenzációt keltett tudományos körökben. Hamar kiderült azonban, hogy termékei nem versenyezhetnek azzal, amit a természet termel.

A robot nem tudta pontosan reprodukálni az aminosav-szekvenciákat, vagyis hibázott. Az egyik láncot egy szekvenciával, a másikat egy kissé módosított szekvenciával szintetizálta. Egy sejtben egy fehérje minden molekulája ideálisan hasonlít egymáshoz, vagyis szekvenciájuk abszolút azonos.

Volt még egy probléma. Még azok a molekulák sem vették fel az enzim működéséhez szükséges térbeli formát, amelyeket a robot megfelelően szintetizált. Így az a kísérlet, hogy a természetet a szerves kémia szokásos módszereivel helyettesítsék, igen szerény sikerre vezetett.

A tudósok csak a természettől tanulhattak, keresve a fehérjék szükséges módosításait. Itt az a lényeg, hogy a természetben folyamatosan vannak olyan mutációk, amelyek a fehérjék aminosav-szekvenciájának megváltozásához vezetnek. Ha kiválasztja a szükséges tulajdonságokkal rendelkező mutánsokat, amelyek egy adott szubsztrátot hatékonyabban dolgoznak fel, akkor egy ilyen mutánsból izolálhat egy megváltozott enzimet, amelynek köszönhetően a sejt új tulajdonságokat szerez. De ez a folyamat nagyon hosszú ideig tart.

Minden megváltozott, amikor megjelent a génsebészet. Hála neki, elkezdtek mesterséges géneket létrehozni bármilyen nukleotidszekvenciával. Ezeket a géneket előkészített vektormolekulákba inszertáltuk, és a DNS-t baktériumokba vagy élesztőbe juttattuk. Ott a mesterséges génből RNS másolatot vettek ki. Ennek eredményeként a szükséges fehérje termelődik. A szintézis hibáit kizártuk. A lényeg a megfelelő DNS-szekvencia kiválasztása volt, majd maga a sejt enzimrendszere is hibátlanul végezte a dolgát. Így arra a következtetésre juthatunk, hogy a génsebészet megnyitotta az utat a fehérjesebészet legradikálisabb formájában.

1.2 Fehérje mérnöki stratégiák

Célzott fehérjemódosítás. A célzott fehérjemódosítás során a tudós a fehérje szerkezetének és funkciójának részletes ismeretét használja fel a kívánt változtatások elvégzéséhez. Általában ennek a módszernek az az előnye, hogy olcsó és technikailag egyszerű, mivel a helyspecifikus mutagenezis technikája jól fejlett. Legfőbb hátránya azonban, hogy egy-egy fehérje részletes szerkezetére vonatkozó információk gyakran hiányoznak, sőt, ha a szerkezet ismert, nagyon nehéz megjósolni a különböző mutációk hatását.

A fehérjemódosító szoftveralgoritmusok olyan új aminosavszekvenciák azonosítására törekszenek, amelyek kis energiát igényelnek egy előre meghatározott célstruktúra kialakításához. Míg a megtalálandó szekvencia nagy, a fehérjemódosítás legnehezebb követelménye az optimális szekvencia azonosításának és meghatározásának gyors, mégis pontos módja, szemben a hasonló szuboptimális szekvenciákkal.

Irányított evolúció. Az irányított evolúció során véletlenszerű mutagenezist alkalmaznak egy fehérjére, és kiválasztják azokat a változatokat, amelyek bizonyos tulajdonságokkal rendelkeznek. Ezután több mutációs és szelekciós kört alkalmaznak. Ez a módszer a természetes evolúciót utánozza, és általában kiváló eredményeket ad az irányított módosításhoz.

A DNS-keverés néven ismert további technika a sikeres variánsok egyes részeit összekeveri és azonosítja a jobb eredmények elérése érdekében. Ez a folyamat utánozza az ivaros szaporodás során természetesen előforduló rekombinációkat. Az irányított evolúció előnye, hogy nem igényel előzetes fehérjeszerkezeti ismereteket, és nem szükséges előre megjósolni, hogy egy adott mutáció milyen hatással lesz. Az irányított evolúciós kísérletek eredményei valóban meglepőek, mert a kívánt változásokat gyakran olyan mutációk okozzák, amelyeknek nem kellene ilyen hatást kifejteniük. Hátránya, hogy ez a módszer nagy áteresztőképességet igényel, ami nem minden fehérje esetében lehetséges. Nagy mennyiségű rekombináns DNS-t kell mutálni, és a termékeket a kívánt minőségre szűrni kell. A rengeteg lehetőség gyakran megköveteli a robotika vásárlását a folyamat automatizálásához. Ráadásul nem mindig könnyű minden érdeklődésre számot tartó tulajdonságot kiszűrni.

II. Példák mesterséges fehérjékre

A fehérjetechnológia alapulhat egy kész fehérje kémiai módosításán vagy olyan géntechnológiai eljárásokon, amelyek lehetővé teszik a természetes fehérjék módosított változatainak előállítását.

Egy specifikus biológiai katalizátor tervezése során figyelembe veszik mind a fehérje specifitását, mind a fémorganikus komplex katalitikus aktivitását. Íme példák a „félszintetikus bioorganikus komplexek” előállítására végrehajtott ilyen módosításokra. A spermiumok mioglobinja képes oxigént kötni, de nincs biokatalitikus aktivitása. Ennek a biomolekulának a három, a fehérjemolekulák felületén lévő hisztidin-maradékokhoz kötődő, ruténiumot tartalmazó elektrontranszfer komplexszel kombinálva olyan komplex képződik, amely képes az oxigén redukálására, miközben egyidejűleg számos szerves szubsztrátot, pl. aszkorbátként, majdnem ugyanolyan sebességgel, mint a természetes aszkorbát-oxidázé. Elvileg a fehérjék más módon is módosíthatók. Vegyük például a papaint. Ez az egyik jól tanulmányozott proteolitikus enzim, amelynek háromdimenziós szerkezetét meghatározták. A fehérjemolekula felületén a cisztein-25 maradék közelében van egy kiterjesztett barázda, amelyben a proteolízis reakció megy végbe. Ez a hely egy flavin-származékkal alkilezhető anélkül, hogy megváltozna a potenciális szubsztrátkötő hely hozzáférhetősége. Az ilyen módosított flavopapainokat M-alkil-1,4-dihidronikotinamidok oxidálására használták, és ezen módosított fehérjék némelyikének katalitikus aktivitása szignifikánsan magasabb volt, mint a természetes flavoprotein-NADH dehidrogenázoké. Így sikerült egy nagyon hatékony félszintetikus enzimet létrehozni. A nagy aktivitású, elhelyezett elektronszívó szubsztituensekkel rendelkező flavinok alkalmazása lehetővé teheti a nikotinamid redukciójára szolgáló hatékony katalizátorok kifejlesztését.

A DNS kémiai szintézisében a közelmúltban elért jelentős előrelépések alapvetően új lehetőségeket nyitottak meg a fehérjefejlesztésben: olyan egyedi fehérjék tervezését, amelyek a természetben nem fordulnak elő. Ez a technológia további fejlesztését igényli, hogy a géntechnológiai módszerekkel történő gének megváltoztatása a fehérjékben előre látható változásokhoz, jól körülhatárolható funkcionális jellemzőik javulásához vezessen: forgási szám, Km egy adott szubsztrátumra, termikus stabilitás, hőmérsékleti optimum, stabilitás, ill. aktivitás nem vizes oldószerekben, szubsztrát- és reakcióspecifitás, kofaktorigény, pH-optimum, proteázrezisztencia, alloszterikus szabályozás, molekulatömeg és alegység szerkezet. Az ilyen javulást jellemzően mutagenezissel és szelekcióval, újabban pedig kémiai módosítással és immobilizálással érik el. Egy adott típusú fehérjemolekula sikeres megtervezéséhez számos alapvető mintázatot kell azonosítani, amelyek összekapcsolják a fehérjék szerkezeti jellemzőit és kívánt tulajdonságaikat. Így a vizsgált fehérjemolekula pontos kristályszerkezetének ismeretében beazonosíthatók azok a részei, amelyeket specifikusan módosítani kell a katalitikus aktivitás növelése érdekében. Egy ilyen módosítás a fehérje aminosavszekvenciájának megváltoztatásából állhat.

Egy másik példa a helyspecifikus mutagenezis megvalósítása. Ez a következőképpen történik. A kutatót érdeklő fehérje génjét klónozzák és megfelelő genetikai hordozóba illesztik. Ezután a kívánt mutációval rendelkező oligonukleotid primert szintetizálják, amelynek tíz-tizenöt nukleotidból álló szekvenciája kellően homológ a természetes gén egy bizonyos régiójával, és így képes hibrid szerkezetet kialakítani vele. Ezt a szintetikus primert a polimerázok használják a vektor komplementer másolatának szintézisének megindítására, amelyet azután elválasztanak az eredetitől, és a mutáns fehérje szabályozott szintézisére használják. Egy alternatív megközelítés a lánc hasításán, a megváltoztatandó hely eltávolításán és a kívánt nukleotidszekvenciájú szintetikus analógra való helyettesítésén alapul.

A tirozil-tRNS szintetáz katalizálja a tirozin tRNS aminoacilezési reakcióját, amely magában foglalja a tirozin ATP általi aktiválását, és tirozil-adenilát keletkezik. Ennek az enzimnek a génjét, amelyet a Bacillus stearothermophilusból izoláltak, az M13 bakteriofágba inszertálták. Az enzim katalitikus tulajdonságait, különösen a szubsztrátkötő képességét ezután helyspecifikus módosítással megváltoztatták. Így a treonin-51 helyébe alanin került. Ez kétszeres növekedést eredményezett a szubsztrátkötésben, nyilvánvalóan azért, mert képtelen volt hidrogénkötést kialakítani e maradék és a tirozil-adenilát között. Ha az alanint prolinnal helyettesítjük, az enzimmolekula konfigurációja megszakad, de a szubsztrát megkötő képessége százszorosára nő, mivel a hisztidin-48-cal való kölcsönhatása megkönnyíti. Hasonló helyspecifikus változásokat tapasztaltak a β-laktamázban, és ezek általában az enzim inaktiválásával járnak. A szerin-70 ciszteinnel való helyettesítése p-tiol-laktamáz képződéséhez vezet, amelynek kötési állandója nem tér el a természetes enzimétől, de a penicillinnel szembeni aktivitása csak 1-2%. Mindazonáltal ennek a mutáns enzimnek az egyes aktivált cefalosporinokkal szembeni aktivitása nem kisebb, mint az eredeti aktivitás, sőt meghaladja azt; ezek a fehérjék a proteázokkal szemben is ellenállóbbak.

A helyspecifikus mutációkat ma már a szerkezeti vizsgálatok megfelelőségének tesztelésére használják. Egyes esetekben sikerült kimutatniuk, hogy egy fehérje szerkezeti stabilitása és katalitikus aktivitása szétválasztható. A fehérje szerkezetének stabilitása és működése közötti összefüggésről kellő mennyiségű információ halmozódott fel, a biológiai katalizátorok aktivitását finomhangolhatjuk, és teljesen szintetikus analógokat állíthatunk elő. Nemrég megjelent egy munka, amely az első szintetikus enzim gén klónozásáról számolt be, amely a ribonukleáz molekula aktív fragmensét kódolja.

III. A Protein Engineering alkalmazásai

A fehérjemérnöki technológiát (gyakran a rekombináns DNS-módszerrel kombinálva) használják a meglévő fehérjék (enzimek, antitestek, sejtreceptorok) tulajdonságainak javítására, és új, a természetben nem létező fehérjék létrehozására. Az ilyen fehérjéket gyógyszerek előállítására, élelmiszer-feldolgozásban és ipari termelésben használják.

A biokatalizátorok bizonyos jellemzői azonban bizonyos esetekben elfogadhatatlanná teszik használatukat. Például a legtöbb enzim lebomlik, ha a hőmérséklet emelkedik. A tudósok megpróbálják leküzdeni az ilyen akadályokat és növelni az enzimek stabilitását zord termelési körülmények között, fehérjetechnológiai technikák segítségével.

Az ipari alkalmazások mellett a fehérjetechnológia méltó helyet kapott az orvosi fejlesztésekben. A kutatók olyan fehérjéket szintetizálnak, amelyek képesek kötődni a vírusokhoz és a daganatokat okozó mutáns génekhez, illetve semlegesíteni azokat; rendkívül hatékony vakcinák létrehozása és sejtfelszíni receptorfehérjék tanulmányozása, amelyek gyakran a gyógyszerek célpontjai. Élelmiszerkutatók fehérjetechnológiát alkalmaznak a növényi alapú fehérjék és zselésítő- vagy sűrítőszerek tartósítási tulajdonságainak javítására.

A fehérjetechnológia másik alkalmazási területe olyan fehérjék létrehozása, amelyek semlegesíthetik a kémiai és biológiai támadásokhoz használható anyagokat és mikroorganizmusokat. Például a hidroláz enzimek képesek semlegesíteni az ideggázokat és a mezőgazdaságban használt peszticideket. Ráadásul az enzimek előállítása, tárolása és felhasználása nem veszélyes a környezetre és az emberi egészségre.

3.1. Peptid- és epitópkönyvtárak

Egy élő szervezetben a legtöbb biológiai folyamatot specifikus fehérje-fehérje vagy fehérje-nukleinsav kölcsönhatások szabályozzák. Ilyen folyamatok közé tartozik például a géntranszkripció szabályozása különböző fehérjefaktorok hatására, a fehérje ligandumok kölcsönhatása a sejtek felszínén lévő receptorokkal, valamint az antigének specifikus megkötése a megfelelő antitestekkel. A fehérje ligandumok receptorokkal való kölcsönhatásának molekuláris mechanizmusainak megértése alapvető és alkalmazott jelentőséggel bír. Különösen az új fehérjegyógyszerek kifejlesztése általában a kezdeti aminosavszekvencia azonosításával kezdődik, amelyik rendelkezik a szükséges biológiai aktivitással (úgynevezett „vezető” szekvencia). A bázikus aminosavszekvenciájú peptidek azonban nemkívánatos biológiai tulajdonságokkal is rendelkezhetnek: alacsony aktivitás, toxicitás, alacsony stabilitás a szervezetben stb.

A peptidkönyvtárak megjelenése előtt biológiai tulajdonságaik javítását nagyszámú analóg szekvenciális szintézisével és biológiai aktivitásuk tesztelésével hajtották végre, ami sok időt és pénzt igényelt. Az elmúlt években lehetővé vált több ezer különböző peptid létrehozása rövid idő alatt automata szintetizátorok segítségével. A célzott mutagenezis kidolgozott módszerei lehetővé tették az egyidejűleg és egymás után biológiai aktivitásra tesztelt fehérjék számának drámai bővítését is. Azonban a peptidkönyvtárak létrehozására csak a közelmúltban kifejlesztett megközelítések vezettek több millió aminosav-szekvencia előállításához, amelyek szükségesek a hatékony szűréshez, hogy azonosítsák köztük azokat a peptideket, amelyek a legjobban megfelelnek a kritériumoknak. Az ilyen könyvtárakat az antitestek antigénekkel való kölcsönhatásának tanulmányozására, új enziminhibitorok és antimikrobiális szerek előállítására, a kívánt biológiai aktivitású molekulák tervezésére vagy új tulajdonságokkal ruházzák fel a fehérjéket, például antitesteket.

Az előállítási módszerek alapján a peptidkönyvtárakat három csoportra osztják. Az első csoportba a peptidek kémiai szintézisével előállított könyvtárak tartoznak, amelyekben az egyes peptideket mikrohordozókra rögzítik. Ezzel a megközelítéssel, miután az egyes reakcióelegyekben egymást követő aminosavakat adtunk a mikrohordozókon immobilizált peptidekhez, az összes reakcióelegy tartalmát egyesítjük és új részekre osztjuk, amelyeket az új aminosav-maradékok hozzáadásának következő szakaszában használunk fel. Egy sor ilyen lépést követően peptideket szintetizálnak, amelyek a szintézisben használt aminosav-szekvenciákat tartalmazzák mindenféle véletlenszerű kombinációban.

A mikrohordozókra immobilizált peptidek könyvtárainak van egy jelentős hátránya: a szűrés során tisztított receptorokat kell használni oldható formában. Ugyanakkor a legtöbb esetben a membránhoz kötődő receptorokat használják leggyakrabban az alap- és farmakológiai kutatások céljára végzett biológiai vizsgálatok során. A második módszer szerint a peptidkönyvtárakat szilárd fázisú peptidszintézissel állítják elő, amelyben a következő aminosavnak a növekvő peptidláncokhoz való kémiai hozzáadásának minden szakaszában az összes vagy néhány prekurzor aminosav ekvimoláris keverékét alkalmazzák. A szintézis utolsó szakaszában a peptideket elválasztják a hordozótól, azaz. oldható formává alakítva őket. A peptidkönyvtárak létrehozásának harmadik megközelítése, amelyet most ismertetünk, éppen a géntechnológiai módszerek fejlődésének köszönhetően vált megvalósíthatóvá. Tökéletesen szemlélteti az ilyen módszerek képességeit, és kétségtelenül jelentős előrelépést jelent alkalmazásuk terén. Ebben a tekintetben részletesebben megvizsgáljuk a peptidkönyvtárak felhasználásának eredményeit a fehérjék epitópjainak (antigéndeterminánsainak) vizsgálatában.

A hibrid fehérjék előállítására szolgáló géntechnológiai technológia lehetővé tette egy hatékony módszer kifejlesztését rövid peptidek előállítására biológiai aktivitásuk elemzésére. Akárcsak a génkönyvtárak esetében, a géntechnológiai módszerekkel kapott peptidkönyvtárak rövid peptidek nagy (gyakran kimerítő) halmazát képviselik. Két közelmúltbeli megfigyelés lehetővé teszi, hogy egy peptidkönyvtárat egyidejűleg és fehérjeepitópok könyvtárának tekintsünk. Először is, a rövid peptidek tartalmazhatják az összes esszenciális aminosav-maradékot, amely nagy szerepet játszik az ellenanyag-kölcsönhatásban, és képesek utánozni a fehérjék nagy antigéndeterminánsait. Másodszor, a legtöbb esetben a fehérje ligandumok néhány legfontosabb aminosav-maradéka és receptoraik között létrejövő nem kovalens kötések jelentős mértékben hozzájárulnak a ligandum-receptor kölcsönhatás összenergiájához. Ezt szem előtt tartva bármely peptid potenciális ligandumnak, hapténnek vagy nagyobb polipeptidek antigéndeterminánsának részének tekinthető, és bármely peptidkönyvtár a megfelelő fehérjereceptorok fehérjeepitópjainak vagy potenciális ligandumainak könyvtárának tekinthető.

A harmadik megközelítés megvalósítása eredményeként kapott peptidkönyvtár a maga modern formájában több tíz vagy akár százmillió rövid, különböző aminosav szekvenciából álló halmaz, amely a bakteriofág virionok felszínén expresszálódik saját részeként. szerkezeti fehérjék. Ez annak köszönhető, hogy a virionjainak megváltozott szerkezeti fehérjéit kódoló hibrid rekombináns géneket géntechnológiai módszerekkel a bakteriofágok genomjába juttatják. (Ezt a módszert fág display néven ismerjük.) Az ilyen gének expressziója következtében hibrid fehérjék képződnek, amelyek N- vagy C-terminálisán további aminosavszekvenciák találhatók.

A peptidek és epitópok könyvtárai szintén felhasználhatók lesznek a humorális immunválasz mechanizmusainak, valamint az immunrendszer betegségeinek vizsgálatában. A legtöbb autoimmun betegséget a szervezet saját antigénjei elleni autoantitestek képződése kíséri. Ezek az antitestek sok esetben egy adott autoimmun betegség specifikus markereiként szolgálnak. Egy epitópkönyvtár segítségével elvileg olyan peptid markerek kinyerésére nyílik lehetőség, amelyek segítségével nyomon követhető lenne az autoantitestek specifitása a kóros folyamat kialakulása során mind egy szervezetben, mind betegcsoportban. és ezen kívül az autoantitestek specificitásának meghatározása ismeretlen etiológiájú betegségekben.

A peptidek és epitópok könyvtárai potenciálisan felhasználhatók immunszérumok szűrésére is olyan peptidek azonosítására, amelyek specifikusan kölcsönhatásba lépnek a védő antitestekkel. Az ilyen peptidek utánozzák a patogén organizmusok antigén-determinánsait, és célpontként szolgálnak a szervezet védő ellenanyagai számára. Ez lehetővé teszi az ilyen peptidek alkalmazását olyan betegek vakcinázására, akiknél hiányoznak a megfelelő kórokozók elleni antitestek. Az epitópok peptidkönyvtárakat használó tanulmányozása speciális esete a ligandumok és receptorok kölcsönhatásának alkalmazott és fundamentális vizsgálatai során alkalmazott számos terület egyikének. Ennek a megközelítésnek a további fejlesztése megkönnyíti a rövid peptideken alapuló új gyógyszerek létrehozását, és hasznos lehet a fehérje-fehérje kölcsönhatások mechanizmusainak alapvető vizsgálataiban.

3.2 Riporterfehérjék fúziós fehérjékben

Egy másik esetben fúziós fehérjéket használnak a rövid peptidek magas szintű expressziójának eléréséhez bakteriális sejtekben, mivel ezek a peptidek a fúziós fehérjékben stabilizálódnak. A hibrid fehérjéket gyakran használják nehezen kimutatható rekombináns fehérjék azonosítására és tisztítására. Például, ha a vizsgált fehérje C-terminálisához galaktozidázt kapcsolunk riporterfehérjeként, lehetőség nyílik a rekombináns fehérje tisztítására a galaktozidáz aktivitás alapján, immunkémiai módszerekkel meghatározva antigéndeterminánsait. A nyílt leolvasási kereteket (ORF) tartalmazó DNS-fragmensek és a riporterfehérjék génjeinek kombinálásával lehetővé válik az ilyen hibrid fehérjék tisztítása a riporterfehérje aktivitása alapján, és laboratóriumi állatok immunizálására használható. A kapott antitesteket ezután a natív fehérje tisztítására használjuk, amely magában foglalja az ORF által kódolt rekombináns polipeptidet, és ezáltal azonosítjuk a klónozott génfragmenst.

A hibrid fehérjék segítségével megoldódik egy ismeretlen gén klónozásának fordított problémája is, amelynek fehérjetermékéhez antitestek vannak. Ebben az esetben az ismeretlen gének ORF-eit reprezentáló nukleotidszekvenciák klónkönyvtárát olyan vektorokban hozzuk létre, amelyek lehetővé teszik az ORF klónozását, hogy ugyanabban a leolvasási keretben kapcsolódjanak a riportergénnel. Az ezen rekombináns gének expressziója eredményeként képződött hibrid fehérjéket antitestek segítségével azonosítják enzim immunoassay módszerekkel. A szekretált fehérjéket és riporter fehérjéket kombináló hibrid gének lehetőséget adnak a szekréció mechanizmusainak újszerű feltárására, valamint a szekretált fehérjék lokalizációjára és mozgására a szövetekben.

3.3 A fehérjefejlesztés néhány vívmánya

A T4 bakteriofág lizozim több aminosavának ciszteinnel való helyettesítésével nagyszámú diszulfidkötést tartalmazó enzimet kaptunk, melynek köszönhetően ez az enzim magasabb hőmérsékleten is megőrizte aktivitását.

Az Escherichia coli által szintetizált humán β-interferon molekulájában a cisztein-maradék szerin-maradékkal való helyettesítése megakadályozta az intermolekuláris komplexek képződését, amelyek körülbelül 10-szeresére csökkentették ennek a gyógyszernek a vírusellenes aktivitását.

Ha a tirozil-tRNS-szintetáz enzim molekulájában a treonint prolinmaradékkal helyettesítették, ennek az enzimnek a katalitikus aktivitása tízszeresére nőtt: gyorsan elkezdte kötni a tirozint a tRNS-hez, amely a transzláció során ezt az aminosavat a riboszómába szállítja.

A szubtilizinek szerinben gazdag enzimek, amelyek lebontják a fehérjéket. Számos baktérium választja ki őket, és az emberek széles körben használják biológiai lebontásra. Szilárdan megkötik a kalcium atomokat, növelve azok stabilitását. Az ipari folyamatokban azonban vannak olyan kémiai vegyületek, amelyek megkötik a kalciumot, ami után a szubtilizinek elvesztik aktivitásukat. A gén megváltoztatásával a tudósok eltávolították az enzimből a kalciumkötésben részt vevő aminosavakat, és az egyik aminosavat másikkal helyettesítették a szubtilizin stabilitásának növelése érdekében. A módosított enzim stabilnak és funkcionálisan aktívnak bizonyult az ipari körülményekhez közeli körülmények között.

Bemutatták egy olyan enzim létrehozásának lehetőségét, amely úgy működik, mint egy restrikciós enzim, amely a DNS-t szigorúan meghatározott helyeken hasítja. A tudósok létrehoztak egy hibrid fehérjét, amelynek egyik fragmentuma felismerte a DNS-molekulában lévő nukleotid-maradékok specifikus szekvenciáját, a másik pedig ebben a régióban fragmentálta a DNS-t.

A szöveti plazminogén aktivátor egy olyan enzim, amelyet klinikailag a vérrögök feloldására használnak. Sajnos gyorsan kiürül a keringési rendszerből, és ismételten vagy nagy adagban kell beadni, ami mellékhatásokhoz vezet. Három célzott mutáció bejuttatásával ennek az enzimnek a génjébe egy hosszú élettartamú enzimet kaptunk, amely megnövekedett affinitással rendelkezik a degradált fibrinhez, és ugyanolyan fibrinolitikus aktivitással rendelkezik, mint az eredeti enzim.

Az inzulinmolekulában lévő egy aminosav helyettesítésével a tudósok biztosították, hogy amikor ezt a hormont szubkután adták be cukorbetegeknek, a vérben a hormon koncentrációjának változása közel volt az étkezés után bekövetkező fiziológiás változáshoz.

Az interferonoknak három osztálya van, amelyek vírusellenes és rákellenes hatással rendelkeznek, de eltérő specifitást mutatnak. Csábító volt egy hibrid interferon létrehozása, amely a három interferontípus tulajdonságaival rendelkezik. Hibrid géneket hoztak létre, amelyek többféle természetes interferon gén fragmentumát tartalmazták. Ezen gének egy része a baktériumsejtekbe integrálódva biztosította a hibrid interferonok szintézisét, amelyek nagyobb rákellenes aktivitással rendelkeznek, mint az anya molekulák.

A természetes emberi növekedési hormon nemcsak ennek a hormonnak a receptorához kötődik, hanem egy másik hormon - a prolaktin - receptorához is. A kezelés során fellépő nem kívánt mellékhatások elkerülése érdekében a tudósok úgy döntöttek, hogy kiküszöbölik annak lehetőségét, hogy a növekedési hormon kapcsolódjon a prolaktin receptorhoz. Ezt úgy érték el, hogy géntechnológiával helyettesítettek néhány aminosavat a növekedési hormon elsődleges szerkezetében.

A HIV-fertőzés elleni gyógyszerek kifejlesztése során a tudósok egy hibrid fehérjét kaptak, amelynek egyik fragmentuma csak a vírus által érintett limfocitákhoz biztosította e fehérje specifikus kötődését, egy másik fragmentum a hibrid fehérje behatolását az érintett sejtbe, egy másik fragmentum pedig megzavarta. fehérjeszintézis az érintett sejtben, ami a halálához vezetett.

A fehérjék a drogok fő célpontjai. Jelenleg mintegy 500 célpont ismert a kábítószer-akció számára. A következő években számuk 10 000-re emelkedik, ami lehetővé teszi új, hatékonyabb és biztonságosabb gyógyszerek létrehozását. A közelmúltban alapvetően új megközelítések születtek a gyógyszerkutatásban: nem egyes fehérjéket, hanem azok komplexeit, fehérje-fehérje kölcsönhatásait és fehérje feltekeredését tekintik célpontnak.

Következtetés

A fehérjemérnöki technológiát (gyakran a rekombináns DNS-módszerrel kombinálva) használják a meglévő fehérjék (enzimek, antitestek, sejtreceptorok) tulajdonságainak javítására, és új, a természetben nem létező fehérjék létrehozására. Az ilyen fehérjéket gyógyszerek előállítására, élelmiszer-feldolgozásban és ipari termelésben használják.

Jelenleg a fehérjetechnológia legnépszerűbb alkalmazása az enzimek katalitikus tulajdonságainak módosítása „környezetbarát” ipari folyamatok kifejlesztése érdekében. Környezetvédelmi szempontból az enzimek a legelfogadhatóbbak az iparban használt összes katalizátor közül. Ezt az biztosítja, hogy a biokatalizátorok képesek vízben oldódni, és semleges pH-jú környezetben, viszonylag alacsony hőmérsékleten teljes mértékben működni. Ezen túlmenően a biokatalizátorok alkalmazása magas specifitásuk miatt nagyon kevés nem kívánt termelési mellékterméket eredményez. A biokatalizátorokat használó, környezetbarát és energiatakarékos ipari folyamatokat régóta aktívan bevezették a vegyipar, a textil, a gyógyszeripar, a cellulóz és papír, az élelmiszeripar, az energia és a modern ipar egyéb területein.

A biokatalizátorok bizonyos jellemzői azonban bizonyos esetekben elfogadhatatlanná teszik használatukat. Például a legtöbb enzim lebomlik, ha a hőmérséklet emelkedik. A tudósok megpróbálják leküzdeni az ilyen akadályokat és növelni az enzimek stabilitását zord termelési körülmények között, fehérjetechnológiai technikák segítségével.

Az ipari alkalmazások mellett a fehérjetechnológia méltó helyet kapott az orvosi fejlesztésekben. A kutatók olyan fehérjéket szintetizálnak, amelyek képesek kötődni a vírusokhoz és a daganatokat okozó mutáns génekhez, illetve semlegesíteni azokat; rendkívül hatékony vakcinák létrehozása és sejtfelszíni receptorfehérjék tanulmányozása, amelyek gyakran a gyógyszerek célpontjai. Élelmiszerkutatók fehérjetechnológiát alkalmaznak a növényi alapú fehérjék és zselésítő- vagy sűrítőszerek tartósítási tulajdonságainak javítására.

A fehérjetechnológia másik alkalmazási területe olyan fehérjék létrehozása, amelyek semlegesíthetik a kémiai és biológiai támadásokhoz használható anyagokat és mikroorganizmusokat. Például a hidroláz enzimek képesek semlegesíteni az ideggázokat és a mezőgazdaságban használt peszticideket. Ráadásul az enzimek előállítása, tárolása és felhasználása nem veszélyes a környezetre és az emberi egészségre.

fehérje mérnöki mutagenezis módosult

Bibliográfia

1. Protein engineering.

2. Protein engineering. A genetika rejtelmei. /Vjacseszlav Markin // Titkok, találós kérdések, tények.

Protein engineering. // Nagy Orosz Enciklopédia.

Protein engineering. // Vegyész kézikönyv 21.

Fehérjefejlesztés és gyógyszerhatékonyság.

Protein engineering. / A.I. Kornelyuk // Biopolimerek és sejt.

A fehérjefejlesztés javítani fogja a gyógyszerek hatékonyságát. // Népszerű mechanika.

Protein engineering. Inzulin fogadása. // Biofile - tudományos és információs magazin.

Biotechnológia. Főbb irányok és eredmények. // Biológia jelentkezőknek és tanároknak.

Bogdanov A.A., Mednikov B.M. Hatalom a gén felett / A. A. Bogdanov, B. M. Mednikov - M.: Oktatás, 1989 - 208. o

Génmanipuláció. // Egészség.

Gének és vegyészek. // Genetika.

13. Glick B., Pasternak J. Molekuláris biotechnológia. Alapelvek és alkalmazás / B. Glick, J. Pasternak. - M.: Mir, 2002.

14. A géntechnológia egyéb alkalmazási területei. / L.V. Timoscsenko, M.V. Chubik // Orvostudomány - hírek és technológiák.

15. Egorova T.A., Klunova S.M., Zhivukhin E.A. A biotechnológia alapjai. / T.A. Egorova, S.M. Klunova, E.A. Zhivukhin - M., 2003.

16. Protein engineering. // Kémia és biotechnológia.

17. Patrusev L.I. Génexpresszió / L.I. Patrusev - M.: Nauka, 2000. - 496 p.

Patrushev L.I. Mesterséges genetikai rendszerek. T. 1: Gén- és fehérjetechnika. /L.I. Patrusev - M.: Nauka, 2004. - 526 p.

Rybchin V.N. A géntechnológia alapjai: Tankönyv egyetemeknek/V.N. Rybchin - St. Petersburg: A Szentpétervári Állami Műszaki Egyetem kiadója, 2002. - 522 p.

Sztyepanov V.M. Molekuláris biológia. A fehérjék szerkezete és funkciói. / V.M. Stepanov - M.: Felsőiskola, 1996.

Biotechnológiai technológiák: fehérjetechnológia, nanobiotechnológia, bioszenzorok és biochipek. / Evgenia Ryabtseva // „Kereskedelmi biotechnológia” - online magazin.

Csernavszkij D.S., Csernavszkaja N.M. Fehérje gép. Biológiai makromolekuláris szerkezetek. / D.S. Csernavszkij, N. M. Csernavszkaja - M.: Moszkvai Állami Egyetemi Kiadó, 1999.

Schultz G.E., Schirmer R.H. A fehérjék szerkezeti szerveződésének elvei. / G.E. Schultz, R.H. Schirmer - M.: Mir, 1982.

24. Brannigan J.A., Wilkinson A.J. Protein engineering 20 éve // ​​Nature Reviews. Molekuláris sejtbiológia. 2002. évf. 3. 12. sz.;

25. Protein engineering. // Wikipédia, a szabad enciklopédia.

A géntechnológiai módszerek, különösen az egyes gének vagy azok részeinek klónozása, valamint a DNS-szekvenálás lehetővé tették a mutagenezis módszertanának jelentős javítását, kiküszöbölve a klasszikus genommutációk indukálására szolgáló módszerek fő hátrányait. A klasszikus genetikai elemzés magában foglalja egy mutagén faktor in vivo hatását a teljes genomra, aminek következtében véletlenszerű, gyakran többszörös mutációk keletkeznek benne, ami nagymértékben megnehezíti a mutánsok azonosítását. A mutáns egyedeket a megváltozott fenotípusos jellemzők alapján azonosítják, és a mutáció természete a DNS-szekvenálás után meghatározható. A modern lokalizált mutagenezis valójában fordított hatásokat foglal magában: először a kérdéses gént vagy szegmensét klónozzák, a szekvenálás során meghatározzák szerkezetét, majd in vitro végrehajtják a szükséges változtatásokat az összetételében. Az indukált mutáció következményeit a mutáns gén eredeti szervezetbe történő bejuttatása után határozzák meg.

A lokalizált mutagenezis legegyszerűbb változata abból áll, hogy egy klónozott DNS-fragmenst az egyik mutagén faktorral kezelünk, de az ilyen expozíció eredményeként véletlenszerű változások is lesznek a fragmentum szerkezetében. A helyi mutagenezis megbízhatóbb és gyakrabban használt módszerei mutagén faktorok alkalmazása nélkül valósulnak meg. A mutációk típusai között a deléciók, inszerciók és nukleotidszubsztitúciók dominálnak.

Törlések. Az ilyen típusú mutációkat a lokalizált mutagenezisben endonukleázok segítségével lehet elérni. Mind restrikciós, mind nem specifikus endonukleázokat alkalmaznak. A restrikciós enzimek használatának legegyszerűbb esete a genom hasítása egy restrikciós enzim segítségével, amely több törést vezet be, hogy ragadós végeket képezzen. A kapott fragmentumokat DNS-ligáz segítségével ismét gyűrűvé zárják, ami olyan molekulák képződéséhez vezethet, amelyek nem tartalmazzák a DNS-szakaszok egyikét. Ez a megközelítés kiterjedt deléciókat eredményez, és jellemzően előzetes kísérletekben alkalmazzák a klónozott DNS viszonylag nagy szakaszai funkciójának meghatározására.

Kis deléciókat a következőképpen kapunk. A klónozott fragmentumot a vektoron belül a megfelelő helyen hasítjuk restrikciós enzim segítségével (21.1. ábra). A kapott lineáris molekulát exonukleáz III-mal kezeljük, amely hidrolizálja a DNS egyik szálát,

a 3' végétől kezdve. Az eredmény egy sor molekula egyszálú, változó hosszúságú 5'-farokkal. Ezeket a farkakat az ssDNS-specifikus S1 nukleáz hidrolizálja, és deléciók jönnek létre a DNS-ben. Használhatja a Bal 31 exonukleázt is, amely mindkét szál lebomlását katalizálja, a lineáris DNS-molekulák végétől kezdve. A nukleotikus reakciók lefolyását az inkubációs idő, a hőmérséklet és az enzimkoncentráció változtatásával szabályozzuk, különböző hosszúságú deléciók kialakulását idézve elő. A lineáris DNS eredményül kapott deléciós változatait gyakran látják el linkerekkel a ciklizálás előtt, így a restrikciós helyek jelen vannak a deléció régiójában. A leírt módszereknek más módosításai is vannak.

Beillesztések (beszúrások). Az inszerciók eléréséhez a klónozott DNS-t restrikciós enzimmel vagy nem specifikus endonukleázzal emésztjük, majd a kapott fragmentumokat ligálják a DNS-be beilleszteni kívánt szegmens jelenlétében. Leggyakrabban kémiailag szintetizált polilinkereket használnak ilyen szegmensként (20. fejezet).

Az inszerciók, akárcsak a deléciók, megzavarhatják egy gén integritását vagy szabályozó régióinak szerkezetét, ami hibás fehérje szintézisét eredményezheti (hosszú deléciók vagy kereteltolódások esetén általában inaktív), vagy megváltozhat a gén transzkripciós folyamata. érdeklődésre. Ily módon gyakran szabályozó mutánsokat nyernek, és expressziós vektorokat állítanak elő (20. fejezet).

Pontmutációk . Ezek a mutációk nukleotidszubsztitúciók. Megszerzésükre többféle megközelítés alkalmazható: citozin dezaminálás, nukleotidanalógok beépítése, nukleotidok helytelen beépítése résjavítás során stb.

Az első módszer azon a tényen alapul, hogy az egyszálú DNS-ben lévő citozin maradékokat biszulfit ionokkal történő kezeléssel uracillá lehet dezaminálni. A DNS-ben az egyszálú régiókat általában restrikciós helyek közelében kapják meg, például az exonukleáz III hatására. Biszulfitos kezelés után az egyszálú hézagokat DNS-polimeráz segítségével kitöltjük, és a végeket ligáljuk. Azokon a helyeken, ahol a dezaminálás során citidilát helyett uridilát képződik, az adenilát a komplementer pozíciót foglalja el, és egy ilyen molekula replikációja során a GC-párt egy AT-pár helyettesíti.

A szubsztitúciók indukálásának másik módja a klónozott DNS restrikciós enzimmel történő kezelése etidium-bromid jelenlétében, amely beépül a bázispárok síkjai közé, és megbontja a duplex szerkezetét. Ennek eredményeként csak egyszálú DNS-törés jön létre. Egy kis rés keletkezik az egyszálú szakadás helyén, majd a dTTP helyett DNS-polimeráz, dATP, dGTP, dCTP és N-4-hidroxi-citozin-trifoszfát jelenlétében helyreállítják. A láncban a timidilát helyett hidroxicitozin-trifoszfát szerepel, de a DNS-replikáció során az adeniláttal és a guaniláttal egyaránt jól párosul. A guanilát egy további replikációs kör után történő felvétele következtében ezen a helyen az AT→GC szubsztitúció következik be (21.2. ábra). Mivel ebben a módszerben a nukleotidpótlást belsőleg hajtják végre

restrikciós helyet, lehetővé válik az eredeti szekvenciával rendelkező és a mutáns vektorok könnyű megkülönböztetése. Ehhez elegendő a kísérletben használt restrikciós enzimmel kezelni őket: a mutáns molekulák nem hasadnak át.

Egy hasonló módszer azon alapul, hogy a négy lehetséges nukleotid közül csak hármat használnak fel egyszálú rés DNS polimerázzal való kitöltésekor. A legtöbb esetben az enzim a molekulának azon a pontján áll le, ahol a hiányzó nukleotiddal komplementer nukleotid keletkezik. Időnként azonban a DNS-polimeráz hibát követ el, és bekapcsolja a jelenlévő három nukleotid egyikét. Ez gyűrűs molekulák kialakulásához vezet, amelyek párosítatlan, nem komplementer nitrogénbázisokat tartalmaznak. Amikor az ilyen vektorokat bejuttatják a baktériumsejtekbe, néhány molekula helyreáll az ilyen károsodások miatt. Ennek eredményeként a replikációt követően a molekulák felében az eredeti szekvencia helyreáll, a másik felében pedig a mutáció rögzül. A mutáns molekulákat a fent leírt módszerrel lehet megkülönböztetni.

Helyspecifikus mutagenezis. A lokalizált mutagenezis jellemzett módszerei abban különböznek, hogy azokat a helyeket, ahol a mutációk előfordulnak, véletlenszerűen választják ki. Ugyanakkor a helyspecifikus mutagenezis technikája lehetővé teszi, hogy mutációkat vigyünk be a gén egy pontosan meghatározott régiójába. Ez adott szekvenciájú szintetikus (kémiai szintézissel nyert) oligonukleotidok felhasználásával történik. Az eljárás kényelmes abból a szempontból, hogy nem igényli megfelelő restrikciós helyek jelenlétét. A módszer heteroduplexek kialakításán alapul a mutációt tartalmazó szintetikus oligonukleotid és a vektorban lévő komplementer egyszálú DNS között.

A következőképpen járjon el. Egy kis oligonukleotidot (8-20 monomer) szintetizálnak, amely komplementer a gén azon részéhez, amelyben mutációt akarnak elérni. Egy vagy több nukleotid szubsztitúció megengedett az oligonukleotid központi régiójában. A vizsgált gént vagy fragmensét egy M13 fágon alapuló vektor részeként klónozzák, hogy cirkuláris egyszálú rekombináns DNS-t kapjanak. A rekombináns vektorokat összekeverjük és oligonukleotidokkal összeforraljuk. Megtörténik az oligonukleotid hibridizációja a komplementer régióval, míg a nem komplementer nukleotidok páratlanok maradnak. Az oligonukleotid primerként működik a DNS polimerázt magában foglaló polimeráz reakcióban in vitro. A gyűrűt ligázok zárják le. A kapott cirkuláris molekulát E. coli sejtekbe juttatják, ahol a mutáns replikációs helyek részleges helyreállítása történik. A mutációk gyakorisága általában 1 és 50% között változik. A mutáns DNS-molekulákat tartalmazó sejtek szelekciója többféle módon történhet, ezek közül az előny a radioaktívan jelölt oligonukleotidot használó módszer, amelyet mutagenezisre használnak. Ebben az esetben ez a nukleotid próbaként szolgál. Az ilyen próba használatának elve azon a tényen alapul, hogy teljesen komplementer a mutáns DNS-sel és részben komplementer a vad típusú DNS-sel. Lehetőség van olyan hibridizációs körülmények (elsősorban hőmérséklet) kiválasztására, hogy a jelölt próba hibridizációja csak az autoradiográfiával kimutatható mutáns DNS-szekvenciával legyen stabil.

A helyspecifikus mutagenezis módszere különösen értékes, mert lehetővé teszi a mutációk izolálását anélkül, hogy ellenőrizné azok fenotípusos megnyilvánulását. Ez a módszer új lehetőségeket nyit meg a génszabályozó elemek funkcióinak tanulmányozásában, lehetővé teszi a promóterek „erősségének” megváltoztatását, a riboszóma kötőhelyek optimalizálását stb. A módszertan egyik fő alkalmazása fehérjemérnökség.

Protein engineering. Ez a kifejezés olyan módszertani technikák összességét jelöli, amelyek lehetővé teszik egy fehérjemolekula rekonstrukcióját megfelelő mutációk strukturális génbe történő célzott bevitelével (helyspecifikus mutagenezis), és ennek következtében a kívánt aminosav-szubsztitúciók a fehérje elsődleges szerkezetébe.

Az aktívabb fehérjék felépítésének szemléltető példája Fersht és munkatársai kísérletei a Bacillus stearothermophilus baktérium tirozil-tRNS-szintetáz enzimjével. Az enzim aktív helyén végbemenő aminosav-szubsztitúciók következményeinek elemzése arra a következtetésre vezetett, hogy a szubsztráttal gyenge hidrogénkötést képző csoportok eltávolítása javíthatja annak affinitását a szubsztráthoz. Azt találták, hogy a treonin-51 (a peptidben az 51. pozíciót foglalja el) hosszú és gyenge hidrogénkötést hoz létre a ribózgyűrű oxigénjével a tirozil-adenilát megkötésekor. Ugyanakkor azt találták, hogy a prolin ugyanazt a pozíciót foglalja el az E. coli baktériumokban. A B. stearothermophilus tirozil-tRNS-szintetáz szerkezetét meghatározó gén helyspecifikus mutagenezise lehetővé tette a helyettesítést thr-51→pro -51 a peptidben. Ennek eredményeként az ATP kötődése az enzim aktív központjában élesen javult, katalitikus aktivitása pedig 25-szörösére nőtt.

A gyakorlati jelentőségű fehérje-rekonstrukció másik, nem kevésbé jelentős példája a Bacillus amyloliquefaciens-ből származó szubtilizin módosítása, amelyet Estell és mtsai. A szubtilizinek olyan szerin proteinázok, amelyeket bacilusok választanak ki a külső környezetbe. Ezeket az enzimeket a biotechnológiai ipar nagy mennyiségben állítja elő, és széles körben használják mosószerekben. A szubtilizinek hátránya a proteolitikus aktivitás éles csökkenése oxidálószerek hatására, beleértve a mosóporokban lévőket is. A BPN szubtilizin molekula rekonstrukciójának célja a kémiai oxidációval szembeni stabilizálás volt.

Az előzetes kísérletekben azt találták, hogy hidrogén-peroxid jelenlétében a szubtilizin gyorsan csökkenti az aktivitást a metionin-222 maradék oxidációja miatt, amely a megfelelő szulfoxiddá alakul. Helyspecifikus mutagenezis módszerekkel ezt a metionint helyettesítettük az összes többi 19 fehérje aminosavval. A mutáns géneket tartalmazó plazmidokat a megfelelő génekben delécióval rendelkező törzsekbe vittük be, és elemeztük a termelt szubtilizinek tulajdonságait. A szerint és alanint222 tartalmazó mutánsok meglehetősen stabilnak bizonyultak a peroxid hatására. A legaktívabb a cisztein-222-t tartalmazó mutáns, fajlagos aktivitása 38%-kal volt magasabb, mint a vad típusú törzsé.

Hasonló módon sikerült növelni a b-interferon aktivitását. A fehérjetechnológia további eredményei közé tartoznak az onkoproteinek transzformáló aktivitásának feltárására irányuló tanulmányok; az enzimek hőstabilitásának megváltoztatása, például termolabilis renin és hőstabil a-amiláz előállítása; a megfelelő plazmamembrán receptor általi inzulinkötés hatékonyságának növelése a hisztidin aszpartáttal történő helyettesítése miatt a hormon b-láncának 10. pozíciójában, valamint sok más példa. Számos fehérjetechnológiai termék talált már gyakorlati alkalmazásra a gyártási folyamatokban.

Tesztkérdések a 3. fejezethez

MAS kiválasztás (marker asszisztens kiválasztás, kiválasztás markerek segítségével).

DNS bevitele növényi sejtekbe Ti- és Ri-plazmidok segítségével.

Az A. tumefaciens daganatok kialakulását okozza a kétszikű növények szárában - az úgynevezett koronaepe. A baktériumok a növényi sejtekhez tapadnak a károsodott területeken. Úgy tűnik, hogy a baktériumok felszínén a kötőhelyek a β-glükán molekulái és a külső membrán lipopoliszacharid O-antigén lánca.

A baktériumok magasabb rendű növényi receptorokhoz kötődnek, amelyek fehérjéből és pektinből állnak; a lektinek ebben az esetben nem fontosak. A baktériumkötő helyek és a növényi receptorok konstitutívak, azaz. mindkét partner birtokolja azokat, még az interakció pillanata előtt. A növénnyel való interakció első lépését - a felismerést - specifikus növényi tapadásnak kell tekinteni. Amint a baktériumok a növényi sejtek felszínéhez tapadnak, elkezdenek cellulózszálakat képezni. Ezek a fibrillumok pásztázó elektronmikroszkópban már 90 perccel azután láthatók, hogy a sárgarépaszövet sejttenyészet szuszpenziójához baktériumokat adtunk. 10 órás inkubáció után a rostok hálózatot alkotnak, amely lefedi a növényi sejtek felszínét. A rostok arra szolgálnak, hogy a baktériumokat erősebben rögzítsék a gazdaszervezet felületéhez. A szabadon lebegő baktériumsejtek cellulózszálakba gabalyodhatnak. Azáltal, hogy a rostok a növény felszínén rögzítik őket, növelik a fertőzések számát. A szaporodás következtében a növény felületén baktériumok felhalmozódása képződik.

A növényi sejtfal a baktériumok pektolitikus enzimek felszabadulása miatt károsodik, ami biztosítja a baktériumok szoros érintkezését a növényi sejt plazmalemmájával. Ez az érintkezés szükséges a DNS-nek a baktériumokból a növényi sejtbe történő átviteléhez. A DNS-transzfer a növényi sejtmembrán integritásának megsértése nélkül történik, de ennek bizonyos állapota - kompetencia - szükséges.

Az A. tumefaciens azon képessége, hogy koronás epetumorok kialakulását indukálja a növényekben, korrelál a Ti plazmid jelenlétével. A tumortranszformáció hipertrófiában nyilvánul meg, amely az agrobaktériumok behatolása után következik be a növények sérült területére (helyére) (13. ábra). Az átalakulás egy nagy plazmid (pTi - tumor indukáló vagy pRi - gyökér indukáló) szegmensének ("transzferált" vagy T-DNS) stabil kovalens beépítésének (inszerciónak vagy integrációjának) eredménye a növényi sejt nukleáris DNS-ébe. .

10. ábra - Az A. tumefaciens növény genetikai kolonizációja: 1- agrobaktériumok léteznek a rizoszférában; 2 - az A. tumefaciens szerkezete; 3 – T-DNS integrációja a genomba; 4 – daganatképződés

Az agrobaktérium egy másik típusa, az A. rhizogenes a „szakállas gyökérnek” nevezett betegséget okozza, amelyben új gyökerek tömege képződik a gyökérkárosodás területén. Az A. rubi rendszerint rendezetlen daganatokat (teratomákat) indukál, az A. radiobacter törzsek avirulensek.

Ellentétben a legtöbb normál növényből vett szövettel, a transzformált szövetek in vitro tenyészetben aszeptikus (steril) körülmények között korlátlanul képesek növekedni külsőleg hozzáadott auxinok és citokininek hiányában. Ezenkívül a transzformált szövetek gyakran egy vagy több opinek nevű vegyületcsoportot szintetizálnak, amelyek általában nem találhatók meg a nem transzformált növényi szövetekben. A legszélesebb körben vizsgált daganatok az Agrobacterium tumefaciens által kiváltott koronaepe. Valóban rosszindulatú daganatok, amelyek növekedést serkentő szerek – a normál szövetek növekedéséhez szükséges fitohormonok – hiányában is növekedhetnek tápközegben.

A daganatok sok éven át fennmaradhatnak in vitro, és ha használják, képesek daganatokat indukálni egészséges növényekben. Természetes körülmények között a koronaepe a gyökér és a szár találkozásánál (a gyökérgallérnál) képződik, innen ered a nevük koronaepe. A koronaepe azonban mind a növény föld alatti részein, például a gyümölcsfák gyökerein, mind a föld feletti részeken, például a szőlő szárán kialakulhat.

Laboratóriumban ezek a betegségek kísérletesen előidézhetők egészséges növényekben, baktériumokkal való megfertőzéssel. A növényeket az oltás előtt meg kell sebezni, a daganatok a növény sérült helyein, általában a növény szárán vagy levelein jelennek meg. Az egész növények mellett explantátumokat, például sárgarépaszeleteket és más növényi szervek darabjait is használják vizsgálati tárgyként.

A koronaepe szövetei magasabb szintű auxint és citokinint tartalmaznak. Egy másik öröklődő változást azonosítottak a koronaepe sejtjeiben - az opinek szintézisét. A növények számára szokatlan vegyületet, egy argininszármazékot, amely csak bizonyos tumorvonalakban található meg, oktopinnak nevezték el. Aztán kimutatták, hogy más tumorvonalak egy másik vegyületet – a nopalint – szintetizálnak, amely szintén az arginin származéka. A daganatban indukált opin típusától függően az A. tumefaciens törzsek és a bennük található Ti plazmidok a megfelelő elnevezést - oktopin vagy nopalin - kapták.

Azokat a daganatot indukáló agrobaktériumokat, amelyekben sem nopalint, sem oktopint nem találtak, korábban nullás típusú törzsnek nevezték. Később kimutatták, hogy a nulladik típusú daganatok a harmadik osztályba tartozó opinokat – az agropinokat – szintetizálják. Más típusú véleményeket is felfedeztek. Mivel minden opin csak a tumorsejtekben található, és hiányzik a normál növényi sejtekben vagy más típusú növényi daganatsejtekben, az opinok a koronaepesejtek specifikus biokémiai markereinek tekinthetők.

Az egy vagy több sejtből kialakuló daganatok gyorsan nagy képződményekké nőnek, amelyek átmérője bizonyos fafajtákon elérheti az egy métert is. A tipikus dezorganizált daganat többé-kevésbé kerek, dedifferenciálódott sejttömeg (callus), amely lehet sima vagy érdes felületű, lehet parenchymás vagy lignified. Néha levélszerű struktúrák (teratomák) képződnek az ilyen daganatok perifériáján, néha pedig járulékos gyökerek. Gyakran másodlagos daganatok figyelhetők meg a fertőzött növényeken, amelyek jelentősen távolodnak az elsődlegestől. Általában az elsődleges daganat felett találhatók, ami arra utal, hogy a baktériumok vagy a transzformáló ágensek a transzspiráció irányába mozognak.

Az Agrobacterium és más fitopatogén baktériumok sejtközi tereken és xilémen keresztüli terjedése jól bizonyított tény. Az agrobaktériumok nagy sebességgel képesek nagy távolságokat megtenni. Nyilvánvalóan nem ez az egyetlen oka a másodlagos daganatok indukciójának. A daganatok szerveződését, nevezetesen a formáját, méretét és a fejlődés természetét három tényező határozza meg:

Agrobacterium törzs,

a gazdanövény genotípusa,

A fertőzött növényi sejtek élettani állapota.

Az Agrobacterium igen széles gazdakörrel rendelkezik, és szinte minden kétszikű növényt képes megfertőzni. Sokáig azt hitték, hogy az egyszikű növények nem érzékenyek az Agrobacterium fertőzésre. Mára kimutatták, hogy bizonyos körülmények között az agrobaktériumok megfertőzhetik az egyszikű növényeket, különösen az olyan családok képviselőit, mint az Amaryllidaceae, Liliaceae, Gramineae, Iridaceae és néhány más család. A különböző Agrobacterium törzsek gazdakörében azonban van némi eltérés: egyes törzsek bizonyos növényfajokon képesek epekőképződést okozni, másokat azonban nem fertőznek meg. Ugyanazon növény különböző fajtái eltérő érzékenységgel is rendelkezhetnek egy adott baktériumtörzzsel szemben.

A természetben a fertőzés lehetetlensége a baktériumokkal való kölcsönhatáshoz szükséges megfelelő receptorok hiánya miatt következik be. Egy másik tényező, amely megakadályozza az egyszikűek Agrobacterium általi fertőzését, az lehet, hogy a növényi sejtekben hiányoznak az Agrobacterium virulenciájának alacsony molekulatömegű induktorai, például az acetosyringon, amelyek általában jelen vannak a sejtnedvben, amikor a kétszikű növények megsérülnek.

Az Agrobacterium plazmidok szerkezetére vonatkozó részletes információkat restrikciós enzimmel vagy fizikai térképezéssel nyertük. A kutatás eredményeként az oktopin és nopalin plazmidok között négy fő homológia területet fedeztek fel. Két konzervált (A és D régió) játszik szerepet az onkogenitásban, egy másik (B) a plazmid replikációt szabályozó régiójának felel meg, míg az utolsó (C) konjugatív transzfer funkciókat kódol (14. ábra).

Így a plazmidok a T-DNS-en kívül tartalmaznak egy konjugációs funkciót kódoló régiót (Tra), egy replikációs régiót (Ori V) és egy virulencia régiót (Vir). A T-DNS-t (határ- vagy terminális régiókat) szegélyező Ti-plazmid szekvenciák fontos szerepet játszanak a növényi genomba való integrációban, és tökéletlen, 24-25 bp-os közvetlen ismétlődéseket tartalmaznak. A T-DNS bal határának deléciója nem befolyásolja a daganatképződést, de a jobb oldali határrégió deléciója a virulencia szinte teljes elvesztéséhez vezet. Kimutatták, hogy a megfelelő ismétlődés vagy annak egy részének törlése a T-DNS növényi DNS-be való beépülési képességének elvesztéséhez vezet. Tekintettel a T-régió végének fontos szerepére a T-DNS transzferben, feltételezhető, hogy az e végek közé beépített bármely DNS-szakasz átvihető a növényekbe a T-DNS részeként. A plazmidokat úgy módosítják, hogy eltávolítsák az összes onkogén szekvenciát, mivel nem vesznek részt sem a gazdasejt genomjába történő átvitelben, sem integrációban. E gének helyére idegen DNS illeszthető be, és a plazmid elveszti onkogén tulajdonságait. A regenerálódó növényekben jelenlévő nem onkogén T-DNS a mendeli törvények szerint terjed. Két módszert fejlesztettek ki a kívánt gént tartalmazó Ti plazmidszekvenciák növénybe történő bejuttatására.

11. ábra - Nopalin és oktopin típusú Ti-plazmidok szerkezete

Az első módszer – a „köztes vektorok” (kointegratív vektorok) módszere – a pBR 322 Escherichia coli plazmid felhasználásán alapul (15. ábra). A T-DNS-t restrikciós enzimek segítségével kivágjuk a Ti plazmidból, és a pBR 322 plazmidba inszertáljuk E. coliba való klónozás céljából. A T-DNS plazmidot tartalmazó baktériumokat felszaporítják, majd a plazmidot izolálják. Ezután a kívánt gént restrikciós enzimek segítségével inszertáljuk a klónozott T-DNS-be. Ezt a rekombináns molekulát, amely a T-DNS-t és a benne inszertált gént tartalmazza, ismét nagy mennyiségben szaporítják, azaz E. coliba klónozzák. Ezután konjugáció segítségével a teljes Ti plazmidot hordozó agrobaktériumokat juttatják be a sejtekbe.

Homológ rekombináció megy végbe a natív Ti plazmid T szegmensei és a köztes vektor között. Ennek eredményeként az integrált gént tartalmazó T-DNS bekerül a natív Ti-plazmidba, helyettesítve a normál DNS-t. A kapott sejtek A. tumefaciens, amelyek Ti-plazmidokat hordoznak a T-szegmensbe beépítve a szükséges génekkel. Ezután az agrobaktériumokra jellemző szokásos módon a növényi sejtekbe kerülnek.

12. ábra - Ti-plazmidon alapuló kointegratív vektor létrehozása: Рр - restrikciós enzimes emésztés

A második módszer bináris (kettős) vektorok rendszerének létrehozásán alapul.

A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a fertőzéshez és transzformációhoz nincs szükség a teljes Ti plazmidra, hanem csak a T-DNS határrégiói és a Ti plazmid egy, a virulenciáért felelős szakasza elegendő. Ráadásul ennek a két DNS-szakasznak nem kell feltétlenül ugyanabban a plazmidban lennie. Ha az Agrobacterium sejtek tartalmaznak egy Ti plazmidot a vir szegmenssel és egy másik plazmidot T-DNS-sel, ezek a baktériumok képesek növényi sejteket transzformálni. Ebben az esetben a T-DNS a benne lévő génekkel integrálódik a növényi genommal, ehhez nincs szükség homológ rekombinációra a baktériumsejtekben. Idegen gének expresszálásához specifikus T-DNS promóterre van szükség, például a nopalin szintetáz promoterre.

Kimutatták, hogy növényi sejtekben működik, és könnyen kombinálható egy idegen gén kódoló szekvenciájával a Ti plazmidok széles körben elterjedt szubklónjaiban. A promóter másik előnye, hogy a kalluszokban és a legtöbb növényi szervben működik. A módosított Agrobacterium T-DNS-sel végzett transzformáció hatékonysága felülmúlja a növénybe történő génátvitel minden más mai módszerét.

Nagyon keveset tudunk arról a mechanizmusról, amellyel az Agrobacterium a T-DNS-t átviszi a növényi magokba: az oktopin és nopalin plazmidok DNS-ének T-szegmensei a gazda kromoszómáinak különböző, látszólag véletlenszerű pontjaiba inszertálódnak, de soha nem integrálódnak a mitokondriális DNS-sel és kloroplasztiszok.

Számos módszer alkalmazható a módosított Ti plazmidok növényi sejtekbe történő bejuttatására. A legegyszerűbb természetes módszer a módosított törzsek beoltása a növény sérült (sérült) területére.

Egy másik módszer a protoplasztok transzformálása agrobaktériumokkal való kokultivációval A kotenyésztési technika a daganatok mesterséges körülmények közötti indukálásának tekinthető: a virulens agrobaktériumokat ideiglenesen protoplasztokkal együtt tenyésztik. Ha agrobaktériumokat adunk frissen izolált vagy egynapos protoplasztokhoz, sem a baktériumok kötődése, sem átalakulása nem figyelhető meg. Az átalakulás elengedhetetlen feltétele az újonnan képződött sejtfal jelenléte a 3 napos protoplasztokban. Ezt igazolja a sejtfalképződést gátló szerek alkalmazása, amelyek a baktériumok megtapadását is gátolják. Egy (egy napnál hosszabb) együtttenyésztés után, amely alatt a protoplasztok baktériumokkal aggregálódnak, a szabad baktériumokat ismételt mosással távolítják el. Ezután a növényi sejteket hormonok hozzáadásával tenyésztjük, majd 3-4 hét múlva kis telepeket vetünk hormonmentes táptalajra. Ezen a táptalajon csak a transzformált sejtek telepei maradnak életben.

Így kerültek elő a transzformált regenerált dohány- és petúnianövények. Ez a módszer lehetővé teszi az agrobaktériumok gazdáinak körének jelentős bővítését, beleértve a gabonafélék családjába tartozó fajait is. A kotenyésztés hatékonysága sejtfúziós induktorok (PEG, kalcium stb.) alkalmazásával növelhető.

A protoplasztok transzformációja úgy is végrehajtható, hogy közvetlenül Ti-plazmidokkal együtt tenyésztjük őket, ilyen kísérleteket petúnia és dohány protoplasztjaival végeztünk. A T-DNS protoplasztokba való beépülésének a korai kísérletekben megfigyelt nagyon alacsony hatékonyságát ezután kémiai stimuláció (PEG) növelte. A transzgenikus növényeket transzformált sejtekből nyertük. Ennek a módszernek az az előnye, hogy nincs szükség köztes vektorokra. A növényi géntechnológia eredményei

Az első transzgenikus növényeket (mikroorganizmusokból származó géneket tartalmazó dohánynövények) 1983-ban szerezték be. A transzgenikus növények (vírusfertőzéssel szemben rezisztens dohánynövények) első sikeres szabadföldi kísérleteit már 1986-ban végezték el az USA-ban.

Az összes szükséges toxicitási, allergenitási, mutagenitási stb. vizsgálat elvégzése után. Az első transzgénikus termékek 1994-ben váltak kereskedelmi forgalomba az Egyesült Államokban. Ezek a Calgen késleltetett érésű Flavr Savr paradicsom és a Monsanto herbicid-rezisztens szójababok voltak. A biotechnológiai cégek 1-2 éven belül génmódosított növények egész sorát dobják piacra: paradicsom, kukorica, burgonya, dohány, szójabab, repce, cukkini, retek, gyapot.

Jelenleg világszerte több száz kereskedelmi cég foglalkozik több mint százmilliárd dollár össztőkével géntechnológiával módosított növények előállításával és tesztelésével. 1999-ben mintegy 40 millió hektár összterületen ültettek transzgénikus növényeket, ami nagyobb, mint egy olyan ország, mint az Egyesült Királyság. Az USA-ban a géntechnológiával módosított növények (GM Crops) a kukorica- és szójababtermés körülbelül 50%-át, a gyapottermesztésnek pedig több mint 30-40%-át teszik ki. Ez arra utal, hogy a génmanipulált növényi biotechnológia már az élelmiszerek és más hasznos termékek előállításának fontos ágazatává vált, jelentős humánerőforrást és pénzügyi áramlásokat vonzva. A következő években a termesztett növények transzgénikus formái által elfoglalt területek további gyors növekedése várható.

A gyakorlati felhasználásra engedélyezett transzgenikus növények első hulláma további rezisztenciagéneket tartalmazott (betegségekkel, gyomirtókkal, kártevőkkel, tárolás közbeni romlással, stresszel szemben).

A növényi géntechnológia fejlődésének jelenlegi szakaszát „metabolikus tervezésnek” nevezik. Ebben az esetben nem annyira a növény bizonyos meglévő tulajdonságainak javítása a feladat, mint a hagyományos nemesítésnél, hanem az, hogy megtanítsuk a növényt teljesen új, az orvostudományban, a vegyiparban és más területeken használt vegyületek előállítására. Ilyen vegyületek lehetnek például speciális zsírsavak, magas esszenciális aminosav tartalmú hasznos fehérjék, módosított poliszacharidok, ehető vakcinák, antitestek, interferonok és egyéb „gyógyszeres” fehérjék, új, környezetet nem szennyező polimerek, stb. , sokkal több. A transzgénikus növények alkalmazása lehetővé teszi az ilyen anyagok nagyüzemi és olcsó előállítását, és ezáltal szélesebb körű fogyasztásra való alkalmassá tételét.

A raktározó fehérjék minőségének javítása

A főbb tenyésztett fajok raktározási fehérjéit szorosan kapcsolódó gének családja kódolja. A magtároló fehérjék felhalmozódása összetett bioszintetikus folyamat. D. Kemp és T. Hall hajtotta végre 1983-ban az Egyesült Államokban az első géntechnológiai kísérletet egy növény tulajdonságainak javítására egy másik növény tárolófehérje génjének bejuttatásával. A babfazeolin gént Ti plazmid segítségével vittük át a napraforgó genomjába. Ennek a kísérletnek az eredménye csak egy kiméra növény, az úgynevezett szanbin. Napraforgósejtekben immunológiailag rokon phaseolin polipeptideket fedeztek fel, amelyek megerősítették a különböző családokba tartozó növények közötti géntranszfer tényét.

Később a phaseolin gén átkerült a dohánysejtekbe: a regenerált növényekben a gén minden szövetben kifejeződött, bár kis mennyiségben. A phaseolin gén nem specifikus expressziója, mint például a napraforgósejtekbe történő átvitele esetében, nagyon eltér ennek a génnek az érett bab sziklevelekben való expressziójától, ahol a fazeolin a teljes fehérje 25-50%-át tette ki. Ez a tény jelzi, hogy meg kell őrizni ennek a génnek a többi szabályozó szignálját a kiméra növények konstruálásakor, valamint a génexpresszió szabályozásának fontosságát a növényi ontogenezis során.

A kukoricatároló fehérjét, a zeint kódoló gén a T-DNS-be való integrálódása után a napraforgó genomjába az alábbiak szerint került át. A zein gént tartalmazó Ti plazmidokat tartalmazó Agrobacterium törzseket napraforgó szárban daganatok indukálására használtuk. A keletkezett daganatok egy része kukoricagénekből szintetizált mRNS-t tartalmazott, ami okot ad arra, hogy ezeket az eredményeket az egyszikű gén kétszikűvé történő transzkripciójának első bizonyítékának tekintsük. A zein fehérje jelenlétét azonban nem mutatták ki a napraforgó szöveteiben.

A géntechnológia reálisabb célja a fehérjék aminosav-összetételének javítása. Mint ismeretes, a legtöbb gabonafélék raktározó fehérjéjében hiányzik a lizin, a treonin, a triptofán, a hüvelyesekben pedig a metionin és a cisztein. További mennyiségű hiányos aminosav bejuttatása ezekbe a fehérjékbe megszüntetheti az aminosav-egyensúly felborulását. Hagyományos nemesítési módszerekkel sikerült jelentősen növelni a gabonatároló fehérjék lizintartalmát. Mindezekben az esetekben a prolaminok (a gabonafélék alkoholban oldódó raktárfehérjéi) egy részét más, sok lizint tartalmazó fehérjékkel helyettesítették. Az ilyen növényekben azonban csökkent a szemcseméret és csökkent a terméshozam. Nyilvánvalóan a prolaminok szükségesek a normál szemtermés kialakulásához, más fehérjékkel való helyettesítésük negatív hatással van a termésre. Ezt a körülményt figyelembe véve a gabonatároló fehérje minőségének javításához olyan fehérjére van szükség, amely nem csak magas lizin- és treonintartalmú, hanem a szemtermés során a prolaminok egy részét is teljes mértékben képes pótolni.

A növények állati fehérjéket is termelhetnek. Így az Arabidopsis thaliana és Brassica napus növények genomjába az Arabidopsis tárolófehérje 25 gén egy részéből és az enkefalin neuropeptid kódoló részéből álló kiméra gén beépítése egy akár 200 ng tömegű kiméra fehérje szintéziséhez vezetett. 1 g magra vonatkoztatva. A két szerkezeti fehérjedomént a tripszin által felismert szekvencia kapcsolta össze, amely lehetővé tette a tiszta enkefalin utólagos könnyű izolálását.

Egy másik kísérletben a transzgenikus növények keresztezése után, amelyek közül az egyikbe a gamma alegység génjét, a másodikba pedig az immunglobulin kappa alegységének génjét helyezték be, mindkét lánc expresszióját sikerült elérni az utódokban. Ennek eredményeként a növény antitesteket képez, amelyek a teljes levélfehérje 1,3%-át teszik ki. Azt is kimutatták, hogy teljesen működőképes szekréciós monoklonális immunglobulinok összeállíthatók dohánynövényekben. A szekréciós immunglobulinok általában az emberek és állatok szájüregébe és gyomrába választódnak ki, és a bélfertőzések első gátjaként szolgálnak. A fent említett munkában monoklonális antitesteket termeltek növényekben, amelyek specifikusak a Streptococcus mutansra, a fogszuvasodást okozó baktériumra. Feltételezhető, hogy a transzgénikus növények által termelt monoklonális antitestek alapján valóban fogszuvasodás elleni fogkrémet lehet létrehozni. Az orvosi jelentőségű egyéb állati fehérjék között kimutatták a humán β-interferon termelődését növényekben.

Megközelítéseket is kidolgoztak a bakteriális antigének növényekben való kinyerésére és vakcinaként való felhasználására. A koleratoxin nem toxikus alegységének oligomereit expresszáló burgonyát kaptak. Ezek a transzgenikus növények felhasználhatók olcsó kolera elleni vakcina előállítására.

Zsírok

A különböző típusú vegyszerek előállításához a legfontosabb nyersanyagok a zsírsavak - a növényi olaj fő összetevője. Szerkezetükben szénláncokról van szó, amelyek hosszuktól és a szénkötések telítettségi fokától függően eltérő fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek. 1995-ben befejeződött a kísérleti tesztelés, és engedélyt kaptak az Egyesült Államok szövetségi hatóságai olyan transzgénikus repcenövények termesztésére és kereskedelmi felhasználására, amelyek növényi olajjal módosított összetételű növényi olajat tartalmaznak, beleértve a szokásos 16 és 18 tagú zsírsavakat is. 45%-ig 12 tagú zsírsav - laurata. Ezt az anyagot széles körben használják mosóporok, samponok és kozmetikumok előállításához.

A kísérleti munka során az Umbellularia califomica növényből származó specifikus tioészteráz génjét klónozták, ahol a magzsír lauráttartalma elérte a 70%-ot. Ennek az enzimnek a génjének szerkezeti részét, a magképződés korai szakaszára specifikus fehérjegén promoter-terminátorának szabályozása alatt, beépült a repce és az Arabidopsis genomjába, ami a lauráttartalom növekedéséhez vezetett. ezeknek a növényeknek az olajában.

A zsírsavak összetételének megváltoztatásával kapcsolatos egyéb projektek között szerepel a növényi olaj telítetlen zsírsavtartalmának növelésére vagy csökkentésére irányuló munka. Érdekesek az olajsav izomerjével, a petroszelinsavval végzett kísérletek, ahol a kettős kötés a hatodik széntag mögött található. Ez a zsírsav a korianderolaj része, és meghatározza annak magasabb olvadáspontját (33 °C), míg olajsav jelenlétében az olvadáspont csak 12 °C. Feltételezik, hogy a petroselinsav szintézisét meghatározó gének növényi olajat termelő növényekbe történő átvitele után lehetőség nyílik telítetlen zsírsavat tartalmazó diétás margarin előállítására. Ezen túlmenően ózonos oxidációval petroszelinsavból nagyon könnyű laurátot nyerni. A zsírsavak biokémiai szintézisének sajátosságainak további tanulmányozása nyilvánvalóan elvezeti a szintézis szabályozásának képességét, hogy különböző hosszúságú és különböző telítettségű zsírsavakat kapjunk, ami jelentősen megváltoztatja a mosószerek, kozmetikumok, édesipari termékek előállítását. , keményítők, kenőanyagok, gyógyszerek, polimerek , dízel üzemanyag és még sok más, a szénhidrogén nyersanyagok felhasználásával kapcsolatos.

Poliszacharidok

Folyamatban van a transzgénikus burgonyanövények és más keményítőt felhalmozó növények létrehozása, amelyekben ez az anyag elsősorban amilopektin, azaz a keményítő elágazó formája, vagy főleg csak amilóz, azaz a keményítő lineáris formái. Az amilopektin vizes oldata folyékonyabb és átlátszóbb, mint az amilózé, amely vízzel kölcsönhatásba lépve merev gélt képez. Például a főként amilopektinből álló keményítő valószínűleg kereslet lesz a különféle táplálkozási keverékek gyártóinak piacán, ahol jelenleg a módosított keményítőt töltőanyagként használják. A plasztidok és a mitokondriumok genomja szintén genetikai módosítás tárgyát képezheti. Az ilyen rendszerek lehetővé teszik a transzgénikus anyag terméktartalmának jelentős növelését.

Herbicidrezisztens növények létrehozása

Az új, intenzív mezőgazdasági technológiákban a gyomirtó szereket igen széles körben alkalmazzák. Ez ehhez kapcsolódik. hogy a korábbi környezetre veszélyes, széles spektrumú, az emlősökre mérgező és a külső környezetben is sokáig fennmaradó gyomirtó szereket új, fejlettebb és biztonságosabb vegyületek váltják fel. Hátrányuk azonban, hogy nemcsak a gyomok, hanem a kultúrnövények növekedését is gátolják.A rendkívül hatékony gyomirtó szereket, például a glifozátot és az atrazinokat intenzíven tanulmányozzák, hogy azonosítsák egyes gyomok velük szembeni toleranciájának mechanizmusát. Így azokon a területeken, ahol az atrazint széles körben használják, számos növényfajban gyakran megjelennek atrazin-rezisztens biotípusok.

A herbicidekkel szembeni rezisztencia mechanizmusának vizsgálata annak érdekében, hogy géntechnológiai módszerekkel olyan termesztett növényeket kapjunk, amelyek rendelkeznek ezzel a tulajdonsággal, a következő szakaszokból állnak: a herbicid hatás biokémiai célpontjainak azonosítása a növényi sejtben: az adott herbicidre rezisztens organizmusok kiválasztása, mint a gyomirtó szerre rezisztens élőlények kiválasztása. rezisztencia gének: ezen gének klónozása: kultúrnövényekbe történő bejuttatásuk és működésük vizsgálata

Négy alapvetően különböző mechanizmus létezik, amely bizonyos kémiai vegyületekkel, köztük a gyomirtókkal szemben rezisztenciát biztosíthat: szállítás, elimináció, szabályozás és érintkezés. A rezisztencia transzportmechanizmusa az, hogy a herbicid nem tud behatolni a sejtbe. A rezisztencia eliminációs mechanizmusának hatására a sejtbe bejutott anyagok indukálható sejtes faktorok, leggyakrabban lebontó enzimek segítségével elpusztulhatnak, és ilyen-olyan módosulásokon is keresztülmennek, így a sejtre ártalmatlan inaktív termékek képződnek. Szabályozó rezisztencia esetén a herbicid által inaktivált sejtfehérje vagy enzim intenzíven szintetizálódik, így megszűnik a kívánt metabolit hiánya a sejtben. A rezisztencia kontaktmechanizmusát a célpont (fehérje vagy enzim) szerkezetének megváltozása biztosítja, amivel a kölcsönhatás a gyomirtó károsító hatásával függ össze.

Megállapítást nyert, hogy a herbicidrezisztencia tulajdonsága monogén, azaz a tulajdonságot leggyakrabban egyetlen gén határozza meg. Ez nagyon egyszerűvé teszi a rekombináns DNS-technológia használatát ennek a tulajdonságnak a átvitelére. A gyomirtó szerek megsemmisítésére és módosítására szolgáló bizonyos enzimeket kódoló gének géntechnológiai módszerekkel sikeresen alkalmazhatók herbicidrezisztens növények létrehozására.

A gyomirtószer-rezisztens fajták létrehozásának hagyományos nemesítési módszerei nagyon időigényesek és nem hatékonyak. A külföldön legszélesebb körben használt gyomirtó szer, a glifozát (kereskedelmi nevén Roundup) az 5-enolpiruvilsikimát-3-foszfát-szintáz (EPS-szintáz) enzimre hatva gátolja az esszenciális aromás aminosavak szintézisét. Az ezzel a gyomirtó szerrel szembeni rezisztencia ismert esetei vagy ennek az enzimnek a szintézise szintjének emelkedésével (szabályozó mechanizmus) vagy egy glifoszfátra érzéketlen mutáns enzim megjelenésével (kontaktmechanizmus) kapcsolódnak. Az EPSF szintáz gént glifoszfát-rezisztens növényekből izoláltuk, és a karfiol mozaikvírus promoter alá helyeztük. Ezt a genetikai konstrukciót Ti-plazmid segítségével petúniasejtekbe vittük be. A transzformált sejtekből regenerált növények a gén egy példányának jelenlétében 20-40-szer több enzimet szintetizáltak, mint az eredeti növényekben, de a glifoszfáttal szembeni rezisztencia csak 10-szeresére nőtt.

A gabonanövényeken használt egyik leggyakrabban használt gyomirtó szer az atrazin. Gátolja a fotoszintézist azáltal, hogy a II. fotorendszer egyik fehérjéhez kötődik, és leállítja az elektrontranszportot. A herbicidrezisztencia a plasztokinon-kötő fehérje pontmutációinak eredményeképpen alakul ki (a szerin glicinnel való helyettesítése), aminek következtében a herbiciddel kölcsönhatásba lép. Számos esetben lehetőség nyílt a mutáns fehérjegén átvitelére atrazin-érzékeny növényekbe Ti-plazmid segítségével. A növényi kromoszómába integrált rezisztencia gént olyan szignálszekvenciával látták el, amely biztosította a szintetizált fehérje kloroplasztiszokba történő szállítását. A kiméra növények szignifikáns rezisztenciát mutattak az atrazinkoncentrációkkal szemben, amelyek a vad típusú fehérjegént tartalmazó kontrollnövények pusztulását okozták. Egyes növények képesek inaktiválni az atrazint azáltal, hogy a klórmaradékot a glutation-S-transzferáz enzimmel eltávolítják. Ugyanez az enzim inaktiválja a triazin sorozat többi rokon herbicidjét (propazin, szimazin stb.).

Vannak olyan növények, amelyek természetes ellenálló képessége a gyomirtó szerekkel szemben a méregtelenítésen alapul. Így a növények klórszulfuronnal szembeni rezisztenciája összefüggésbe hozható a herbicid molekula dezaktiválásával annak hidroxilezése, majd a bevitt hidroxilcsoport glikozilációja révén. Kórokozókkal és kártevőkkel szemben rezisztens növények létrehozása Az egyes kórokozókkal szembeni rezisztencia leggyakrabban összetett többgénes tulajdonság.

Több lókusz egyidejű átvitele még géntechnológiai módszerekkel is nehézkes, nem beszélve a klasszikus szelekciós módszerekről. Egy másik módszer egyszerűbb. Ismeretes, hogy a rezisztens növények megváltoztatják az anyagcseréjüket, ha kórokozók támadják meg őket. Az olyan vegyületek, mint a H2O2, a szalicilsav és a fitoallexinek felhalmozódnak. Ezen vegyületek megnövekedett szintje segít a növénynek ellenállni a kórokozóknak.

Íme egy példa, amely bizonyítja a szalicilsav szerepét a növények immunválaszában. A szalicilát-hidroláz (ez az enzim lebontja a szalicilsavat) szintézisét szabályozó bakteriális gént tartalmazó transzgenikus dohánynövények nem tudtak immunválaszt kiváltani. Ezért a szalicilsavszint vagy a növények termelésének genetikai megváltoztatása a H2O2 kórokozóra adott válaszként ígéretes lehet rezisztens transzgenikus növények létrehozásában.

A fitovirológiában széles körben ismert a növények vírusfertőzésekkel szembeni keresztrezisztenciájának jelensége. Ennek a jelenségnek az a lényege, hogy egy növény fertőzése a vírus egyik törzsével megakadályozza ezen növények későbbi fertőzését egy másik vírustörzzsel. A vírusfertőzés visszaszorításának molekuláris mechanizmusa még mindig nem tisztázott. Kimutatták, hogy az egyes vírusgének, például a kapszidfehérjék génjeinek bevitele elegendő a növények immunizálásához. Így a dohánymozaikvírus burokfehérjéjének génjét átvitték a dohánysejtekbe, és olyan transzgenikus növényeket kaptak, amelyekben az összes levélfehérje 0,1%-át a vírusfehérje képviseli. E növények jelentős része nem mutatta a betegség tüneteit, amikor vírussal fertőződött meg. Lehetséges, hogy a sejtekben szintetizált vírusburok fehérje megakadályozza, hogy a vírus RNS normálisan működjön, és teljes értékű vírusrészecskéket képezzen. Megállapítást nyert, hogy a dohánymozaik vírus, lucerna mozaik vírus, uborka mozaik vírus és burgonya vírus X kapszid fehérje expressziója a megfelelő transzgenikus növényekben (dohány, paradicsom, burgonya, uborka, paprika) magas szintű védelem a későbbi vírusfertőzések ellen. Ezen túlmenően a transzformált növényekben nem csökkent a termékenység, nem változtak nemkívánatos változások az eredeti példányok és utódaik növekedésében és élettani jellemzőiben. Úgy gondolják, hogy a növények vírusokkal szembeni rezisztenciáját egy speciális vírusellenes fehérje okozza, amely nagyon hasonlít az állati interferonhoz. Lehetségesnek tűnik a génsebészet alkalmazása az ezt a fehérjét kódoló gén expressziójának fokozására, amplifikálásával vagy erősebb promoterrel való helyettesítésével.

Megjegyzendő, hogy a géntechnológia alkalmazását a növények különféle kórokozó mikroorganizmusok elleni védelmére nagymértékben hátráltatja a növényvédelmi reakciók mechanizmusainak ismerete. A növénytermesztésben a rovarkártevők leküzdésére vegyi anyagokat - rovarölő szereket - használnak. Az emlősökre azonban káros hatással vannak, elpusztítják a jótékony rovarokat, szennyezik a környezetet, az utakat, ráadásul a rovarok gyorsan alkalmazkodnak hozzájuk. Több mint 400 rovarfajról ismert, hogy ellenálló az alkalmazott rovarölő szerekkel szemben. Ezért egyre nagyobb figyelmet kapnak a biológiai védekezési szerek, amelyek biztosítják a hatás szigorú szelektivitását és a kártevők alkalmazkodásának hiányát az alkalmazott biopeszticidhez.

A Bacillus thuringiensis baktérium már régóta ismert, és olyan fehérjét termel, amely nagyon mérgező számos rovarfaj számára, ugyanakkor biztonságos az emlősök számára. A fehérjét (delta endotoxin, CRY protein) a B. thuringiensis különféle törzsei termelik. A toxin és a receptorok kölcsönhatása szigorúan specifikus, ami megnehezíti a toxin-rovar kombináció kiválasztását. A természetben nagyszámú B. thuringiensis törzset találtak, amelyek toxinjai csak bizonyos rovarfajtákat érintenek. A B. thuringiensis készítményeket évtizedek óta használják rovarok elleni védekezésre szántóföldeken. A toxin és az azt alkotó fehérjék biztonságossága emberek és más emlősök számára teljes mértékben bizonyított. A fehérje génjének a növényi genomba történő beillesztése lehetővé teszi olyan transzgenikus növények előállítását, amelyeket a rovarok nem esznek meg.

A rovarokra kifejtett fajspecifikus hatás mellett a prokarióta delta-toxin gének növényi genomba történő integrálása még erős eukarióta promóterek kontrollja mellett sem vezetett magas szintű expresszióhoz. Ez a jelenség feltehetően abból adódik, hogy ezek a bakteriális gének lényegesen több adenin és timin nukleotid bázist tartalmaznak, mint a növényi DNS. Ezt a problémát módosított gének létrehozásával oldották meg, ahol bizonyos fragmentumokat kivágtak és hozzáadtak a természetes génből, megőrizve a delta toxin aktív részeit kódoló doméneket. Ilyen megközelítésekkel például a Colorado burgonyabogárral szemben rezisztens burgonyát kaptak. A toxin szintetizálására képes transzgénikus dohánynövényeket kaptak. Az ilyen növények érzéketlenek voltak a Manduca sexta hernyókkal szemben. Ez utóbbi 3 napon belül elpusztult a méregtermelő növényekkel való érintkezés után. A toxintermelés és az ebből eredő rovarokkal szembeni rezisztencia domináns tulajdonságként öröklődött.

Jelenleg a gyapot és a kukorica úgynevezett Bt-növényei (a B. thuringiensis-ből) adják a géntechnológiával módosított növények teljes mennyiségének zömét ezekből a növényekből, amelyeket az Egyesült Államokban termesztenek.

A géntechnológia azon képessége miatt, hogy mikrobiális eredetű toxinok alapján entomopatogén növényeket tud építeni, a növényi eredetű toxinok még nagyobb érdeklődésre tartanak számot. A fitotoxinok gátolják a fehérjeszintézist, és védő funkciót töltenek be a rovarkártevők, mikroorganizmusok és vírusok ellen. A legjobban tanulmányozott a ricin, amelyet ricinusban szintetizálnak: génjét klónozták és nukleotidszekvenciáját meghatározták. A ricin emlősökre gyakorolt ​​magas toxicitása azonban a vele végzett géntechnológiai munkát csak olyan ipari növényekre korlátozza, amelyeket nem használnak élelmiszerként vagy állati takarmányként. Az amerikai phytolacca által termelt toxin hatékony a vírusok ellen, és ártalmatlan az állatokra. Hatásmechanizmusa az, hogy inaktiválja saját riboszómáit, amikor különféle kórokozók, köztük fitovírusok jutnak be a sejtekbe. Az érintett sejtek nekrotikussá válnak, ami megakadályozza, hogy a kórokozó elszaporodjon és elterjedjen a növényben. Jelenleg folynak a kutatások e fehérje génjének tanulmányozására és más növényekbe való átvitelére.

A vírusos megbetegedések elterjedtek a rovarok körében, így a természetes rovarvírusok, amelyek készítményeit vírusirtó szernek nevezik, a rovarkártevők elleni védekezésre használhatók. A növényvédő szerekkel ellentétben szűk hatásspektrumúak, nem pusztítják el a hasznos rovarokat, a külső környezetben gyorsan lebomlanak, és nem veszélyesek a növényekre és az állatokra. A rovarvírusok mellett egyes rovarkártevőket támadó gombákat biopeszticidként használnak. A jelenleg használt biopeszticidek entomopatogén vírusok és gombák természetes törzsei, de nem zárható ki annak lehetősége, hogy a jövőben géntechnológiai módszerekkel új, hatékony biopeszticideket hozzanak létre.

Növeli a növény ellenálló képességét a stresszes körülményekkel szemben

A növények nagyon gyakran vannak kitéve különféle kedvezőtlen környezeti tényezőknek: magas és alacsony hőmérséklet, nedvességhiány, talaj sótartalma és környezetszennyezés, bizonyos ásványi anyagok hiánya vagy éppen ellenkezőleg, túlzott mennyisége stb. Sok ilyen tényező létezik, ezért számos módja van az ellenük való védekezésnek – a fiziológiai tulajdonságoktól a szerkezeti adaptációkig, amelyek lehetővé teszik, hogy legyőzzék káros hatásaikat.

A növények egy adott stressztényezővel szembeni rezisztenciája sokféle gén hatásának eredménye, így nem lehet a tolerancia tulajdonságok teljes átadásáról egyik növényfajról a másikra géntechnológiai módszerekkel beszélni. A géntechnológiának azonban van némi lehetősége a növények rezisztenciájának javítására. Ez olyan egyedi génekkel végzett munkára vonatkozik, amelyek szabályozzák a növények stresszhelyzetekre adott metabolikus reakcióit, például a prolin túltermelése ozmotikus sokk hatására, sótartalom, speciális fehérjék szintézise hősokkra reagálva stb. További mélyreható tanulmányok fiziológiai, biokémiai és genetikai alapja A növény környezeti feltételekre adott válasza kétségtelenül lehetővé teszi a géntechnológiai módszerek alkalmazását rezisztens növények tervezésére.

A fagyálló növények előállításának egyelőre csak közvetett megközelítése figyelhető meg, amely a Pseudomonas syringae-vel végzett géntechnológiai manipulációkon alapul. Ez a növényekkel együtt élő mikroorganizmus hozzájárul a korai fagyok által okozott károkozásukhoz, A jelenség mechanizmusa abból adódik, hogy a mikroorganizmus sejtjei egy speciális fehérjét szintetizálnak, amely a külső membránban lokalizálódik, és a jégkristályosodás központja. Ismeretes, hogy a jég képződése a vízben olyan anyagoktól függ, amelyek a jégképződés központjaként szolgálhatnak. A növény különböző részein (levél, szár, gyökér) jégkristályok képződését okozó fehérje az egyik fő tényező a korai fagyokra érzékeny növényi szövetek károsodásáért. Számos, szigorúan ellenőrzött körülmények között végzett kísérlet kimutatta, hogy a steril növényeket -6-8 °C-ig nem károsítják a fagyok, míg a megfelelő mikroflórával rendelkező növényekben már -1,5-2 °C hőmérsékleten is előfordultak károsodások. E baktériumok mutánsai, azok, amelyek elvesztették a jégkristályok képződését okozó fehérje szintetizálásának képességét, nem növelték a jégképződés hőmérsékletét, és az ilyen mikroflórával rendelkező növények fagyállóak voltak. A burgonyagumókra permetezett ilyen baktériumtörzs versenyzett a hagyományos baktériumokkal, ami a növények fagyállóságának növekedéséhez vezetett. Talán az ilyen, géntechnológiai módszerekkel létrehozott és a külső környezet összetevőjeként használt baktériumok a fagy leküzdését szolgálják.

A biológiai nitrogénkötés hatékonyságának javítása

A molekuláris nitrogén ammóniummá történő redukciójáért felelős enzimet jól tanulmányozták. - nitrogenáz. A nitrogenáz szerkezete minden nitrogénmegkötő szervezetben azonos. A nitrogénkötés során nélkülözhetetlen élettani feltétel a nitrogenáz védelme az oxigén hatására bekövetkező pusztulástól. A legjobban vizsgált nitrogénmegkötők a hüvelyesekkel szimbiózist alkotó rhizobia és a szabadon élő Klebsiella pneumoniae baktérium. Megállapítást nyert, hogy ezekben a baktériumokban 17 gén, az úgynevezett nif gének felelősek a nitrogén megkötéséért. Mindezek a gének egymáshoz kapcsolódnak, és a hisztidin bioszintézis enzimjei és a sikiminsav felszívódását meghatározó gének közötti kromoszómán helyezkednek el. A gyorsan növekvő rhizobiában a nif gének 200-300 ezer bázispárt tartalmazó megaplazmid formájában léteznek.

A nitrogénfixáló gének közül olyan géneket azonosítottak, amelyek a nitrogenáz, az elektrontranszportban szerepet játszó fehérjefaktor és a szabályozó gének szerkezetét szabályozzák. A nitrogénkötő gének szabályozása meglehetősen összetett, ezért a nitrogénmegkötő funkciónak a baktériumoktól közvetlenül a magasabb rendű növényekhez való genetikailag módosított átvitele jelenleg már nem esik szóba. Mint a kísérletek kimutatták, még a legegyszerűbb eukarióta szervezetben, az élesztőben sem sikerült elérni a nif gének expresszióját, bár azokat 50 generáción keresztül megőrizték.

Ezek a kísérletek kimutatták, hogy a diazotrófia (nitrogénfixáció) kizárólag a prokarióta szervezetekre jellemző, és a nif gének túl bonyolult szerkezetük és a nif régión kívüli gének általi szabályozásuk miatt nem tudták leküzdeni a prokarióták és eukarióták elválasztó gátját. Sikeresebb lehet a nif gének Ti plazmidokkal történő kloroplasztiszokba történő átvitele, mivel a kloroplasztiszokban és a prokarióta sejtekben a génexpresszió mechanizmusa hasonló. A nitrogenázt mindenesetre védeni kell az oxigén gátló hatásától. Ezenkívül a légköri nitrogén rögzítése nagyon energiaigényes folyamat. Nem valószínű, hogy a nif gének hatása alatt álló növény olyan radikálisan megváltoztathatja anyagcseréjét, hogy mindezen feltételeket megteremtse. Bár elképzelhető, hogy a jövőben géntechnológiai módszerekkel gazdaságosabban működő nitrogenáz komplexet lehet létrehozni.

Reálisabb a géntechnológiai módszerek alkalmazása a következő problémák megoldására: a rhizobia hüvelyesek kolonizáló képességének növelése, a nitrogénkötés és asszimiláció hatékonyságának növelése a genetikai mechanizmus befolyásolásával, új nitrogénmegkötő mikroorganizmusok létrehozása nif gének bejuttatásával. , átadva a szimbiózis képességét a hüvelyesekről másokra .

A géntechnológia elsődleges célja a biológiai nitrogénkötés hatékonyságának javítása érdekében fokozott nitrogénkötő és kolonizáló képességű rhizobia törzsek létrehozása. A hüvelyes növények rhizobia általi megtelepedése nagyon lassan megy végbe, csak néhányuk ad gócokat. Ennek az az oka, hogy a rhizobia invázió helye csak egy kis terület a gyökér növekedési pontja és a legközelebbi gyökérszőr között, amely kialakulási stádiumban van. A növény gyökerének minden más része és a fejlett gyökérszőrzet érzéketlen a kolonizációra. Egyes esetekben a kialakult csomók nem képesek megkötni a nitrogént, ami sok növényi géntől függ (legalább ötet azonosítottak), különösen két recesszív gén kedvezőtlen kombinációjától.

A hagyományos genetikai és szelekciós módszerekkel nagyobb kolonizációs képességű rhizobia törzseket lehetett előállítani. De szabadföldi körülmények között versenyeznek a helyi törzsekkel. Versenyképességük növelése láthatóan géntechnológiai módszerekkel érhető el. A nitrogénkötési folyamat hatékonyságának növelése a génkópiák növekedésén alapuló géntechnológiai technikák alkalmazásával, azon gének transzkripciójának fokozásával, amelyek termékei a nitrogénkötés kaszkádmechanizmusában „szűk keresztmetszetet” képeznek, erősebb promóterek bevezetésével stb. fontos magának a nitrogénnek a hatékonyságának növeléséhez.genáz rendszer, amely közvetlenül redukálja a molekuláris nitrogént ammóniává.

A fotoszintézis hatékonyságának növelése

A C4 növényeket magas növekedési sebesség és fotoszintézis sebesség jellemzi, gyakorlatilag nincs látható fénylégzésük. A legtöbb C3-as növényekhez tartozó növény nagy intenzitású fotolégzéssel rendelkezik. A fotoszintézis és a fotorespiráció szorosan összefüggő folyamatok, amelyek ugyanazon kulcsenzim, a ribulóz-biszfoszfát-karboxiláz (RuBPC) bifunkciós aktivitásán alapulnak. A RuBP karboxiláz nemcsak CO2-t, hanem O2-t is képes hozzáadni, azaz karboxilezési és oxigénezési reakciókat hajt végre. Amikor a RuBP oxigénnel telítődik, foszfoglikolát képződik, amely a fotorespiráció fő szubsztrátjaként szolgál - a fényben a CO2 felszabadulási folyamata, amelynek eredményeként a fotoszintetikus termékek egy része elvész. A C4 növények alacsony fotorespirációját nem a glikolát útvonal enzimeinek hiánya magyarázza, hanem az oxigenáz reakció korlátozottsága, valamint a CO2 fotorespiráció reasszimilációja.

A géntechnológia előtt álló egyik kihívás a túlnyomó karboxiláz aktivitással rendelkező RuBPA létrehozásának lehetőségének tanulmányozása.

Új tulajdonságokkal rendelkező növények beszerzése

Az elmúlt években a tudósok új megközelítést alkalmaztak „antiszensz RNS-sel” (fordított vagy antiszensz RNS-sel) rendelkező transzgenikus növények előállítására, amelyek lehetővé teszik számukra a kérdéses gén működésének szabályozását. Ebben az esetben a vektor megalkotásakor a beépített gén DNS-másolata (c-DNS) 180°-kal elfordul. Ennek eredményeként a transzgenikus növényben egy normál mRNS-molekula és egy fordított molekula képződik, amely a normál mRNS komplementaritása miatt komplexet képez vele, és a kódolt fehérje nem szintetizálódik.

Ezt a megközelítést használták jobb gyümölcsminőségű transzgénikus paradicsomnövények előállítására. A vektor tartalmazta a PG gén c-DNS-ét, amely szabályozza a poligalakturonáz, a növényi szövetek sejtközi terének fő alkotóeleme, a pektin elpusztításában szerepet játszó enzim szintézisét. A PG géntermék a paradicsom gyümölcseinek érési időszakában szintetizálódik, és mennyiségének növekedése a paradicsom puhábbá válásához vezet, ami jelentősen csökkenti az eltarthatóságát. Ennek a génnek a transzgénekben való letiltása lehetővé tette új gyümölcstulajdonságokkal rendelkező paradicsomnövények előállítását, amelyek nemcsak sokkal tovább tartottak, hanem maguk a növények is ellenállóbbak voltak a gombás betegségekkel szemben.

Ugyanez a megközelítés alkalmazható a paradicsomérés időzítésének szabályozására is, és ebben az esetben az EFE (etilénképző enzim) gént használjuk célpontként, amelynek terméke az etilén bioszintézisében részt vevő enzim. Az etilén egy gáznemű hormon, melynek egyik funkciója a gyümölcsérés folyamatának szabályozása.

Az antiszensz konstrukciók stratégiája széles körben alkalmazható a génexpresszió módosítására. Ezt a stratégiát nemcsak új tulajdonságokkal rendelkező növények előállítására használják, hanem a növénygenetikai alapkutatásokra is. Érdemes megemlíteni még egy irányt a növényi géntechnológiában, amelyet egészen a közelmúltig főleg alapkutatásban alkalmaztak - a hormonok növényfejlődésben betöltött szerepének vizsgálatára. A kísérletek lényege az volt, hogy bizonyos bakteriális hormongének kombinációjával transzgénikus növényeket kapjanak, például csak iaaM vagy ipt stb. Ezek a kísérletek jelentősen hozzájárultak az auxinek és citokininek növényi differenciálódásban betöltött szerepének bizonyításához.

Az utóbbi években ezt a megközelítést kezdték alkalmazni a gyakorlati kiválasztásban. Kiderült, hogy az iaaM gént tartalmazó transzgenikus növények termései, amelyek a Def gén (egy csak gyümölcsben expresszálódó gén) promotere alatt találhatók, partenokarpikusak, vagyis beporzás nélkül képződnek. A partenokarpos gyümölcsöket a magvak teljes hiánya vagy nagyon kis száma jellemzi, ami lehetővé teszi az „extra magok” problémájának megoldását, például görögdinnyében, citrusfélékben stb. Már előkerültek a transzgénikus cukkini növények, amelyek általában nem különböznek a kontroll növényektől, de gyakorlatilag nem tartalmaznak magot.

A tudósok aktívan használják a hatástalanított Ti-plazmidot, amely mentes az onkogénektől, hogy mutációkat szerezzenek. Ezt a módszert T-DNS inszerciós mutagenezisnek nevezik. A T-DNS a növény genomjába integrálódva kikapcsolja azt a gént, amelybe integrálódott, és funkcióvesztésével könnyen kiválaszthatók a mutánsok (az elnémítás jelensége - géncsendesítés). Ez a módszer abból a szempontból is figyelemre méltó, hogy lehetővé teszi a megfelelő gén azonnali kimutatását és klónozását. Jelenleg sok új növényi mutációt nyertek ilyen módon, és a megfelelő géneket klónozták. M. A. Ramenskoy a T-DNS mutagenezis alapján olyan paradicsomnövényeket kapott, amelyek nem specifikusan rezisztensek a késői fertőzéssel szemben. A munka másik aspektusa nem kevésbé érdekes - megváltozott dekoratív tulajdonságokkal rendelkező transzgénikus növényeket kaptunk. Az egyik példa a színes virágú petúnia növények termesztése. Következő a kék rózsa, amelynek génje a kék pigment szintézisét szabályozza, delphiniumból klónozva. A transzgénikus növények biológiai biztonságának problémái

A „transzgénikus” élelmiszerek fogyasztásával szembeni egyik fő kifogás az antibiotikum-rezisztencia gének (különösen a kanamicin) jelenléte, amelyek az eredeti DNS-tervben szelektívként szerepeltek.

Feltételezések szerint ezek a rezisztencia gének az élelmiszerek emésztése során átkerülhetnek az endogén mikroflórába, beleértve a kórokozókat is, aminek következtében a mikrobák rezisztenssé válhatnak egy adott antibiotikummal szemben. A valóságban azonban egy ilyen esemény valószínűsége elhanyagolható – a természetben végzett számos kísérlet és megfigyelés ilyen horizontális géntranszferrel eddig csak negatív eredménnyel járt.

Nem szabad megfeledkeznünk arról, hogy a növényekbe épített rezisztencia gének csak eukarióta sejtekben vannak „hangolva” kifejeződésre, baktériumsejtekben nem. Figyelembe kell venni azt is, hogy ezeket a szelektív géneket a mikroorganizmusok természetes populációiból vették, ahol ma már széles körben elterjedtek az antibiotikumok orvosi gyakorlatban történő aktív felhasználása következtében. Ezért összehasonlíthatatlanul reálisabb annak a valószínűsége, hogy egy antibiotikum-rezisztenciagén természetes tározóból bekerüljön az emberi mikroflórába, mint transzgenikus növények fogyasztása esetén. A közvéleményre tekintettel azonban olyan megközelítéseket dolgoznak ki, amelyek kiküszöbölik a „gyanús” gének jelenlétét a kereskedelmi forgalomba hozott transzgenikus formákban.

Az esetek többségében az antibiotikum-rezisztencia marker génjeit most herbicidrezisztencia gének váltják fel. Igaz, a „herbicid” gének használata is találkozik kifogásokkal, de ezúttal a környezetvédők részéről. Számos módszert javasoltak a markergén szelektív eliminálására a kívánt transzgenikus növény megszerzése után, amikor már nincs rá szükség.

Nagyon ígéretesnek tűnik a szelektív gének riporterekkel való helyettesítése a transzgenikus növények szelektálásakor, vagy alternatív szelektív gének alkalmazása, például a fitohormonok szintézisére vagy a poliszacharidok speciális formáinak hidrolízisére szolgáló gének, amikor növényeket termesztenek tenyésztő tápközegben. Így még ez az antibiotikum-rezisztencia-génekkel kapcsolatos virtuális veszély is hamarosan megszűnik.

Ami a transzgénikus növények lehetséges toxicitását vagy allergenitását illeti, itt ugyanazok a szigorú előírások vonatkoznak, mint a hagyományosan előállított új kultúrnövény-fajtákra vagy új típusú élelmiszerekre. Ezekben a paraméterekben nem várható különösebb különbség a transzgénikus és a normál növények között (kivéve talán a jobbat, amikor a toxinok vagy allergének szintézise blokkolva van), sőt általában a gyakorlatban nem figyelhetők meg.

A lehetséges környezetkárosítás problémájának több aspektusa van. Először is aggodalomra ad okot, hogy a herbicidrezisztens kultúrnövények az interspecifikus beporzás révén átvihetik ezeket a géneket egymáshoz szorosan kapcsolódó gyomokra, amelyek elpusztíthatatlan szupergyomokká fejlődhetnek. Bár az események ilyen nemkívánatos fejlődésének valószínűsége a legtöbb növény esetében nagyon kicsi, a génmérnökök és a mezőgazdasági tudósok aktívan dolgoznak ki módszereket az ilyen veszélyek kiküszöbölésére. Itt azonban meg kell jegyezni, hogy ez a kérdés sem új keletű, hiszen számos, hagyományos nemesítéssel előállított gyomirtószer-rezisztens fajtát régóta alkalmaznak a mezőgazdasági gyakorlatban. Ugyanakkor az ilyen rezisztens fajták széles körű elterjedése még nem okozott környezeti katasztrófát.

Ennek ellenére ebben az esetben a transzgenikus növények esetleges kifogásainak kivédése érdekében megpróbálnak például nem egy, hanem több, különböző gyomirtó szerekkel szembeni rezisztencia gént bevinni a növényekbe. Több gén átvitele a gyomokba sokkal kevésbé valószínű, mint egyetlen gén. Ezen túlmenően a többszörös gyomirtó szerrel szembeni rezisztencia lehetővé teszi a különböző gyomirtó szerek rotációját a kultúrnövények kezelése során, ami nem teszi lehetővé egyetlen specifikus rezisztenciagén elterjedését a gyomokban.

Azt is javasolják, hogy a rezisztencia géneket ne a nukleáris genomba, hanem a kloroplasztisz genomjába vigyék be. Ezzel megelőzhető a nem kívánt genetikai sodródás a virágporon keresztül, mivel a kloroplasztiszok csak az anyai vonalon keresztül öröklődnek.

Egy másik, genetikailag módosított módszer a gyomok elleni védekezésre anélkül, hogy általánosságban herbicidrezisztencia-géneket használnánk, a biotranszgén. Ez azt jelenti, hogy kis állatokat, például nyulakat használnak a szántóföldi gyomok elfogyasztására. Ugyanakkor a kultúrnövények elfogyasztásától való megóvása érdekében valamilyen gént lehet beléjük juttatni, ami miatt az adott állat számára nem vonzó (illat, íz) válik. Egy ilyen biotranszgénikus megközelítés azonnal megszüntetné a transzgénikus növényekkel szemben jelenleg felvetett kifogások többségét.

Lényegében hasonló környezeti kifogások vonatkoznak a beépített „rovarölő” génekkel rendelkező transzgénikus növényekre, amelyekről úgy tartják, hogy képesek kiváltani a rovarkártevők tömeges ellenállásának kialakulását. Hatékony módszereket is javasol ennek a veszélynek a csökkentésére, például számos különböző toxin gének és/vagy indukálható promóterek alkalmazását, amelyek gyorsan aktiválódnak, amikor a rovarok megtámadják a növényt. Ez a probléma általában nem új keletű, mivel a ma „génszinten” használt rovarirtó szereket már régóta tiszta anyag formájában használták a növények permetezésére.

Az inszekticid génekkel rendelkező transzgenikus növények használatának egy másik nemkívánatos következménye, hogy ezeknek a növényeknek a pollenje mérgező is lehet az ezzel a virágporral táplálkozó hasznos rovarokra. Néhány kísérleti adat erre utal. hogy egy ilyen veszély valóban fennáll, bár ennek lehetséges mértékéről még nehéz beszélni. Azonban itt is javasoltak és teszteltek már megfelelő géntechnológiai megoldásokat, például a kloroplaszt DNS-en keresztüli transzgenózist, vagy a pollenben nem működő promotereket.

A hozzáfűzött remények A genetikailag módosított (GM) növények két fő területre oszthatók:

1.A növényi termékek minőségi jellemzőinek javítása.

2. A növénytermesztés produktivitásának és stabilitásának növelése a növények kedvezőtlen tényezőkkel szembeni ellenállásának növelésével.

A géntechnológiával módosított növények létrehozását leggyakrabban a következő konkrét problémák megoldására végzik:

1) A termelékenység növelése érdekében:

a) kórokozókkal szembeni rezisztencia;

b) herbicidekkel szembeni rezisztencia;

c) ellenáll a kedvezőtlen hőmérsékletnek és az alacsony talajminőségnek;

d) a termelékenységi jellemzők (íz- és táplálkozási tulajdonságok, optimális anyagcsere) javítása.

2) Farmakológiai célokra:

a) terápiás szerek gyártóinak megszerzése;

b) antigének termelői, akik élelmiszer-passzív immunizálást biztosítanak.

A DNS-technológia fő feladatai a GM növények létrehozásában a mezőgazdaság és a társadalom modern fejlődési feltételei között meglehetősen változatosak, és a következők:

1. Hibridek előállítása (kompatibilitás, hímsterilitás).

2. A növények növekedésének és fejlődésének optimalizálása (a növények habitusának változásai - például magasság, levelek és gyökérrendszer stb.; virágzás változásai - például a virágok szerkezete és színe, virágzási idő).

3. A növények táplálkozásának optimalizálása (a légköri nitrogén rögzítése nem hüvelyes növények által; az ásványi tápelemek jobb felszívódása; a fotoszintézis hatékonyságának növelése).

4. Termékminőség javítása (zsírok összetételének és/vagy mennyiségének megváltoztatása; élelmiszerek ízének és illatának megváltoztatása; új típusú gyógyászati ​​alapanyagok beszerzése; textil alapanyagok rost tulajdonságainak megváltoztatása; az érés minőségének és időzítésének megváltoztatása vagy gyümölcs tárolása).

5. Az abiotikus stressztényezőkkel szembeni rezisztencia növelése (szárazsággal és sótartalommal szembeni ellenállás. Hőállóság; árvízállóság; hideghez való alkalmazkodás; herbicidekkel szembeni ellenálló képesség; talaj savassággal és alumíniummal szembeni ellenállás; nehézfémekkel szembeni ellenállás).

6. Fokozott rezisztencia a biotikus stressztényezőkkel szemben (rezisztencia a kártevőkkel szemben4 rezisztencia bakteriális, vírusos és gombás betegségekkel szemben).

A gyomirtószer-rezisztenciát meghatározó gének közül a gyomirtókkal, például a glifozáttal (Roundup) szembeni rezisztencia génjeit már klónozták. Foszfinotricin (Bialafos), ammónium-glifozinát (Basta), szulfonilurea és imidazolin gyógyszerek. E gének felhasználásával már előállítottak transzgénikus szójababot, kukoricát, gyapotot stb. A gyomirtó szerekkel szemben ellenálló transzgénikus növényeket Oroszországban is tesztelik. A Biomérnöki Központ létrehozta a Basta-rezisztens burgonyafajtát, amely jelenleg szántóföldi kísérletek alatt áll.

n A géntechnológiával módosított (GM) transzgénikus növények teljes termesztési területe a világon 2004-ben 81 millió hektár volt

n Ezek alapvetően GM-módosítottak a kórokozókkal és herbicidekkel szembeni rezisztencia szempontjából

Ezek a tanulmányok hozzájárulnak a mezőgazdaságban új megközelítések kidolgozásához - betegségek diagnosztizálásához, a fajták és fajták genetikai tulajdonságainak azonosításához az új, javított tulajdonságokkal rendelkező állatok és növények szelekciójához a genomban bekövetkezett célzott változások alapján. Az állatok és növények modern DNS-technológiáiban három fő területet lehet megkülönböztetni:

1) DNS - a genetikai anyag áramlásának szabályozására szolgáló technológiák (kiválasztás molekuláris genetikai markerek segítségével - MAS, erre a célra - feltérképezés, a főbb gének jelölése a mennyiségi tulajdonságokhoz - QTL); a biológiai sokféleség megőrzése molekuláris genetikai markerek segítségével; genetikai alapú nemesítési programok kidolgozása és a szülői élőlényformák szelekciója a környezetgenetikai adatok figyelembevételével.

2) DNS-technológia új élőlényformák létrehozására „bioreaktorok” (az ember számára terápiásán fontos fehérjék termelői) előállítása érdekében, a különböző betegségek kialakulásának és megelőzésének genetikai mechanizmusainak tanulmányozása, valamint a szervezet szerkezeti és funkcionális szerveződésének alapkutatása. genetikai anyag, intergénikus kölcsönhatások.

3) DNS technológia a kívánt genotípusok célzott előállítására és szaporítására - embrionális őssejtvonalak felhasználása, bizonyos gének célzott módosítása, egypetéjű ikrek előállítása stb.

DNS-ökológia. Számos környezeti és agroökológiai probléma, amelyek megoldásában nagy reményeket fűznek a DNS-technológiához, összetett természetű. Ezek közé tartozik a talaj termékenységének növelésének problémája. A főként nitrogéntartalmú műtrágyák ilyen célú használata két okból nem hozza meg a kívánt hatást. Először is, a nitrogéntartalmú műtrágyák kémiai szintézise energiaigényes és költséges folyamaton keresztül megy végbe. Másodszor, a talajban a szükséges műtrágyakoncentráció megteremtése érdekében feleslegben kerülnek kijuttatásra és jelentős mennyiségben kimosódnak, ami a víztestek szennyezéséhez és a környezet nemkívánatos környezeti változásaihoz vezet. Ebben a tekintetben a DNS-technológiáknak módokat kell kifejleszteniük a biológiai nitrogénmegkötő rendszer használatára a növények ammóniumsók biztosítására. A probléma megoldására több lehetőség kínálkozik: szabadon élő nitrogénmegkötő baktériumok vagy izolált módosított nitrogenáz (a biológiai nitrogénkötésért felelős enzim) alkalmazása az ammónia ipari előállításában; a természetes nitrogénmegkötő baktérium-szimbionták hatékonyságának növelése és új szimbiotikus asszociációk kialakítása; nitrogénkötő gének (nif gének) bejuttatása kultúrnövényekbe... stb.

1. A géntechnológia ígéretes fejlesztései.

2. Mik azok a rekombináns DNS-molekulák?

3. Mi a genetikai átalakulás egy növényben?

4. Sorolja fel a növényi géntechnológia főbb módszereit!

5. Ismertesse a légköri nitrogén biológiai megkötésének fokozásának módjait!

Irodalom:

1. Alberts B., Bray D., Lewis J. és munkatársai, Molecular Biology of cells. T. 1 - 3. M.: Mir, 1994.

2. Genomelemzés. Módszerek / Szerk. K. Davis. M.: Mir, 1990. 246 p.

3. Atanasov A. Biotechnológia a növénytermesztésben. Novoszibirszk: ICGSO RAS, 1993. – 241 p.

4. Baranovov V. S. Génterápia - a 21. század orvoslása // Soros oktatási folyóirat. 3. szám 1999. P. 3 – 68.

5. Becker M.E., Liepins G.K., Raipulis E.P. Biotechnológia. M.: Agropromizdat, 1990. 334 p.

6. Boriszjuk N.V. Szomatikus hibridek molekuláris genetikai felépítése // Biotechnológia. A tudomány és a technológia eredményei VINITI AN USSR. M., 1988. T. 9. P. 73 -113.

7. Valikhanova G. Zh. Növényi biotechnológia. Almaty: Konzhyk, 1996. 272. o.

8. Gleba Yu. Yu. Növény biotechnológia // Soros oktatási folyóirat. 6. szám 1998. P. 3 – 8.

9. Glebov O.K. A szomatikus sejtek genetikai transzformációja // Sejttenyésztési módszerek. L.: Nauka, 1988.

10. Goldman I. L., Razin S. V., Ernst L. K., Kadulin S. G., Grashchuk M. A. Idegen gének pozíció-független expressziójának problémája transzgenikus állatok sejtjeiben // Biotechnológia. 1994. 2. sz.

11. Dyban A.P., Gorodetsky S.I. Idegen gének bevezetése az emlős genomjába: utak és kilátások // A biotechnológia molekuláris és sejtes vonatkozásai. L.: Nauka, 1986. 82-97.

12. Egorov N. S., Samuilov V. D. Modern módszerek a mikroorganizmusok ipari törzseinek létrehozására // Biotechnológia. Könyv 2. M.: Felsőiskola, 1988. 208 p.

13. Zvereva S. D., Romanov G. A. Riporter gének a növények géntechnológiájához: jellemzők és vizsgálati módszerek // Növényfiziológia. 2000. T. 47, 3. sz. P. 479-488.

14. Leshchinskaya I. B. Géntechnológia // Soros oktatási folyóirat. 1996. 1. sz. 33-39.

15. Li A., Tinland B. A t-DNS integrációja a növényi genomba: prototípus és valóság // Plant Physiology. 2000, 47. évfolyam, 3. szám, 354-359

16. Lutova L. A., Provorov N. A., Tikhodeev O. N. és munkatársai: Növényfejlődés genetikája. Szentpétervár: Nauka, 200. 539 p.

17. Lewin B. Gének. M.: Mir, 1987. 544 p.

18. Piruzyan E. S., Andrianov V. M. Az agrobaktériumok plazmidjai és a növények géntechnológiája, M.: Nauka, 1985. 280 p.

19. Piruzyan E. S. Növények géntechnológiája, M.: Znanie, 1988. 64 p.

20. Piruzyan E. S. A növények géntechnológiájának alapjai M.: Nauka, 1988. 304 p.

21. Piruzyan E. S. Idegen gének expressziójának problémái növényekben // A tudomány és a technológia eredményei VINITI. Ser. Biotechnológia. 1990. T. 23. 176 p.

22. Popov L. S., Yazykov A. A. Transzgénikus állatok, mint modellek az embrionális fejlődés és az emberi betegségek reprodukciójának tanulmányozására // Advances in modern biology. 1999. T 119, 1. szám P. 30-41.