22. Metode de izolare a culturilor pure de aerobi.
Procesul de izolare a unei culturi pure poate fi împărțit în mai multe etape.
Primul stagiu. Se prepară un frotiu din materialul examinat, se colorează cu Gram sau o altă metodă și se copiază microscopic. Pentru inoculare, materialul de testat, dacă este necesar, este diluat într-o eprubetă cu o soluție sterilă izotonică de clorură de sodiu. O picătură din diluția preparată este aplicată în buclă pe suprafața agarului nutritiv într-un vas Petri și frecată bine în mediu cu o spatulă, distribuind uniform materialul pe întreaga sa suprafață. După însămânțare, cupa se întoarce cu susul în jos, se etichetează și se pune într-un termostat la o temperatură de 37 °C timp de 18-24 ore.
Faza a doua. Ei se uită prin vase și studiază coloniile izolate, acordând atenție formei, dimensiunii, consistenței și altor caracteristici ale acestora. Pentru a determina morfologia celulelor și proprietățile lor tinctoriale, se prepară un frotiu dintr-o parte a coloniei studiate, colorat cu Gram și microscopat. Pentru a izola și a acumula o cultură pură, o colonie izolată sau mai multe colonii izolate diferite sunt subcultivate în tuburi separate cu agar înclinat sau alt mediu nutritiv. Pentru a face acest lucru, o parte a coloniei este îndepărtată cu o buclă, fără a atinge coloniile învecinate.
A treia etapă: Se notează modelul de creștere al culturii pure izolate. O cultură vizual pură se caracterizează printr-o creștere uniformă. Examinarea microscopică a unui frotiu colorat preparat dintr-o astfel de cultură relevă celule omogene din punct de vedere morfologic și tinctorial. Totuși, în cazul polimorfismului pronunțat inerent unor tipuri de bacterii, în frotiurile dintr-o cultură pură, alături de cele tipice, se găsesc și alte forme celulare.
23. Metode de izolare a culturilor pure de anaerobi.
Mediile nutritive pentru anaerobi trebuie să îndeplinească următoarele cerințe de bază: 1) să satisfacă nevoile nutriționale; 2) asigura o crestere rapida a microorganismelor; 3) să fie redus în mod adecvat
Inoculările în scopul izolării microflorei anaerobe, atât formatoare de spori (clostridii), cât și neformatoare de spori (veillonella, bacteroides, peptococi), se efectuează în condiții strict anaerobe. Inoculările primare se fac pe medii de îmbogățire (tioglicolat, Kitta - Tarozzi), apoi subcultivate pe medii solide: agar-sânge cu zahăr în vase Petri, într-o coloană mare de agar nutritiv cu zahăr sau alte medii pentru a obține colonii izolate. După incubarea culturilor în condiții anaerobe, frotiurile sunt preparate din coloniile bacteriene rezultate, colorate, microscopate și apoi subcultivate pe mediu Kitt-Tarozzi și medii de agar pentru a izola o cultură pură.
La izolarea bacteriilor anaerobe care formează spori (clostridii), inoculările inițiale sunt încălzite într-o baie de apă la o temperatură de 80 °C timp de 20 de minute pentru a distruge celulele vegetative ale microflorei străine care pot fi prezente în materialul de testat.
24. Identificarea microorganismelor morfologice, culturale serologice, biologice, genetice.
Identificarea este determinarea unei poziții sistematice, separarea de orice sursă la nivelul unei specii sau al unei variante.
25. Metoda de identificare biochimică: determinarea proteoliticului. proprietăți zaharolitice, lipolitice, identificarea hemolizinelor și oxidoreductazelor. Utilizarea analizoarelor microbiologice automate .
Această metodă presupune studiul degradării enzimatice a diferitelor substraturi (glucide, aminoacizi și proteine, uree, peroxid de hidrogen etc.) cu formarea de intermediari și finale.
produse.
Carbohidrazele- enzime care descompun carbohidrații. Prin determinarea carbohidrazelor, așa-numitele proprietăți zaharolitice ale microbilor. În acest scop, se folosesc următoarele medii:
a) Suport media (lichid și semi-lichid cu indicatori). Ca acesta din urmă se utilizează reactivul Andrede, albastru de bromotimol sau BP.Activitatea enzimatică a bacteriilor se apreciază după modificarea culorii mediului și formarea gazului;
b) medii de diagnostic diferenţial cu lactoză (Endo, Levina, Ploskireva etc.);
c) medii policarbohidrate (cum ar fi Olkenitsky, Kligler etc.).
Proteaze-enzime care descompun proteinele:
a) cultura studiată poate descompune proteinele substrat cu formarea de peptonă, albumină și aminoacizi. Acest proces are loc datorită enzimelor proteinaze și peptidaze. Pentru identificarea acestor enzime, cultura studiată se inoculează pe o serie de medii: zer coagulat, o coloană de gelatină (lichefiere în cazuri pozitive), agar cu lapte într-o cutie Petri (în cazuri pozitive apar zone de turbiditate în jurul coloniilor) ;
b) descompunerea aminoacizilor de către microbi se poate produce prin decarboxilare sau dezaminare. În primul caz, se formează amine dintr-un aminoacid sau altul, care sunt detectate fie prin electroforeză. sau prin alcalinizarea mediului. Prezența deaminazelor într-un microb se apreciază prin formarea de amoniac în mediu ca urmare a procesului de dezaminare a aminoacizilor;
c) descompunerea aminoacidului triptafan prin acţiunea enzimei triptafanaze este însoţită de formarea indolului. Acesta din urmă este detectat folosind o bucată de hârtie umezită cu acid oxalic și fixată sub un dop deasupra mediului nutritiv. În cazuri pozitive, bucata de hârtie devine roșie;
d) pentru identificarea enzimelor pentru descompunerea aminoacizilor care conțin sulf (cistina, cisteină), se efectuează teste pentru H2S, ca produs al descompunerii acestor aminoacizi de către desulfuraze. Prezența H2S este detectată și în mediul lui Olkenitsky;
e) pentru a identifica ureaza, la mediul nutritiv se adaugă la pH neutru o enzimă care descompune ureea, ureea și un indicator. În cazuri pozitive, mediul își schimbă culoarea din cauza unei schimbări a pH-ului către partea alcalină din cauza formării amoniacului. Lipaze- enzime pentru descompunerea lipidelor si lipoidelor. Cel mai adesea, lecitinaza este determinată prin placare pe agar cu gălbenuș. Lecitinaza descompune lecitina în fosfocolină și digliceride. În aceste cazuri, pe măsură ce coloniile cresc, în jurul lor apar zone opalescente, reflectând activitatea lecitinazei.
Enzime toxine : Hemolizinele sunt enzime care descompun membrana fosfolipidă a eritrocitelor. Ele sunt detectate prin inocularea culturii pe agar sânge (5-10%). Există b-hemoliză sau hemoliză completă, când în jurul coloniilor se formează zone de curățare, a-hemoliză, hemoliză incompletă, când există zone verzi în jurul coloniilor. Absența hemolizei este denumită d-hemoliză.
Citotoxine- enzime care au un efect toxic asupra celulelor țintă. De exemplu, citotoxicitatea toxinei microorganismelor anaerobe este determinată în cultura celulară. În acest scop, 1 g de material (fecale sau altele) este diluat în tampon fosfat 1:10 masă/volum, centrifugat timp de 30 min la 4000 rpm. Supernatantul este filtrat pe un filtru de 20 nm, adăugat la un monostrat de cultură de celule McCoy și incubat la 37°C timp de 24-48 ore până când se obține un efect toxic.
Determinarea imunochimică a producției de toxine: de regulă, pentru determinarea multor exotoxine se folosește o metodă imunosorbantă legată de enzime - difterie, holeră, stafilococ etc. În acest scop, se folosesc sisteme de testare bazate pe anticorpi monoclonali la o anumită exotoxină.
Pasmocoagulaza- o enzimă care coagulează plasma sanguină a animalelor. Determinată într-o reacție în eprubetă. În 1 ml de plasmă de citrat de iepure sau uman (întreg sau diluat de 2 și 4 ori cu ser fiziologic), se agită o buclă de cultură zilnică de agar a microbului. Amestecul este incubat într-un termostat la 37°C. În cazuri pozitive, după 2-4 ore plasma se coagulează (apare un cheag). Lecitinaza - vezi mai sus.
Oxido reductaze:
1. Definiție oxidaze. Fâșiile din cultura de testare sunt aplicate în buclă pe hârtie de filtru umezită cu o soluție 1% de tetrametilparafenilendiamină. Într-un caz pozitiv, apare culoarea violetă a dungilor (în decurs de 1 min).
2. Determinarea catalazei. O picătură de soluție de peroxid de hidrogen 3% este aplicată pe o lamă de sticlă și acolo este introdusă o buclă a culturii de testare. În prezența catalazei, se formează bule de oxigen.
3. Determinarea dehidrazelor. Prezența dehidrazelor este judecată după capacitatea de reducere a microbilor, adică. capacitatea de a reduce unii coloranți organici (de exemplu, soluție apoasă 1% de albastru de metilen). Se adaugă un colorant (acceptor de hidrogen) într-o coloană de agar cu zahăr (donator de hidrogen) și cultura microbiană este inoculată cu o injecție. În cazuri pozitive, microbul care crește pe un astfel de mediu îl decolorează.
4. Determinarea spectrului de acizi grași cu lanț scurt (SCFA), Microorganismele anaerobe produc produse intermediare, inclusiv acizi grași cu lanț scurt și alcooli, al căror spectru (profil) este diferit în diferite tipuri de microorganisme și permite identificarea microorganismelor la nivel de gen. Cei mai frecvent testați sunt acizii acetic, propionic, butilic, izobutil, valeric, izovaleric, caproic și izocaproic. Pentru determinarea SCFA se folosește metoda cromatografiei gaz-lichid. Sunt identificate microorganisme precum actinomicetele, prolionibacteria, eubacteria, bifidobacteria și clostridiile.
În ultimii ani, laboratoarele bacteriologice au folosit sisteme comerciale de testare pentru identificarea biochimică rapidă (determinarea activității biochimice a diferitelor grupuri de microorganisme): de exemplu, teste 2O pentru enterobacterii și teste ZO pentru anaerobi. Schema de identificare include următorii pași:
Colonii ---- Pregatire ---- Cerere ----- Incubare ---- Contabilitate (+ -) ---- Inter-
suspensii suspensii 4 ore 37°C prezentare miercuri
Ca material de identificare se folosește o colonie bine izolată pe o placă sau o cultură pură într-o eprubetă, din care se prepară o suspensie în concentrația standardului de densitate optică N4, apoi se adaugă în godeuri 55 μl de suspensie. cu mediile acestui sistem de testare. Placa cu benzi este incubată la 37°C timp de 4 ore. Contabilitatea poate fi efectuată automat (folosind dispozitivul ATV) sau vizual. Rezultatul unei reacții biochimice este evaluat sub formă de „+” sau „-” și se introduce un tabel de referință în care un rezultat pozitiv corespunde unei expresii numerice , rezultând un anumit profil numeric corespunzător unui index de profil analitic special dezvoltat, care vă permite să identificați rapid unul sau altul
microorganism.
Metoda lui Pasteur (metoda diluării limitatoare). Constă în realizarea unei serii de diluții succesive din materialul studiat într-un mediu nutritiv lichid. Pentru a face acest lucru, o picătură de inocul este introdusă într-o eprubetă cu un mediu lichid steril, picătura din aceasta este transferată în eprubeta următoare și până la 8...10 eprubete sunt inoculate în acest fel. Cu fiecare diluție, numărul de celule microbiene care intră în mediu va scădea și este posibil să se obțină o astfel de diluție în care în toată eprubeta cu mediul să fie o singură celulă microbiană, din care să se producă o cultură pură a microorganismului. dezvolta. Deoarece microbii cresc difuz în medii lichide, de ex. sunt ușor de distribuit în mediul înconjurător, este dificil să izolați o celulă microbiană de alta. Astfel, metoda lui Pasteur nu oferă întotdeauna o cultură pură. Prin urmare, în prezent, această metodă este utilizată în principal pentru reducerea preliminară a concentrației de microorganisme în material înainte de a-l inocula într-un mediu solid pentru a obține colonii izolate.
Metode de separare mecanică a microorganismelor folosind medii nutritive solide. Astfel de metode includ metoda Koch și metoda Drigalski.
Metoda Koch (metoda de semănat adânc). Materialul de testat este introdus cu o buclă bacteriologică sau o pipetă Pasteur într-o eprubetă cu un mediu nutritiv dens topit. Amestecați conținutul eprubetei în mod uniform, rotindu-l între palme. O picătură din materialul diluat este transferată în a doua eprubetă, de la a doua la a treia etc. Conținutul fiecărei eprubete, începând de la prima, se toarnă în vase Petri sterile. După ce mediul s-a solidificat în vase, acestea sunt plasate într-un termostat pentru cultivare.
Pentru a izola microorganismele anaerobe prin metoda Koch, este necesar să se limiteze accesul oxigenului la cultură. În acest scop, suprafața de însămânțare profundă într-un vas Petri este umplută cu un amestec steril de parafină și vaselină (1:1). De asemenea, puteți lăsa inoculul, bine amestecat cu mediul de agar, direct în eprubetă. În acest caz, dopul de bumbac este înlocuit cu unul de cauciuc sau suprafața agarului este umplută cu un amestec de parafină și vaselină. Pentru a extrage coloniile crescute de microorganisme anaerobe, tuburile sunt ușor încălzite prin rotirea rapidă peste flacăra arzătorului. Agarul adiacent pereților se topește, iar coloana alunecă cu ușurință în placa Petri pregătită. Apoi, coloana de agar este tăiată cu un bisturiu steril, coloniile sunt îndepărtate cu o buclă sterilă sau cu un tăietor capilar steril și transferate într-un mediu lichid.
metoda Drigalski se bazează pe separarea mecanică a celulelor microbiene pe suprafața unui mediu nutritiv dens în vase Petri. Fiecare celulă microbiană, fixându-se într-un anumit loc, începe să se înmulțească, formând o colonie.
Pentru însămânțare folosind metoda Drygalsky, se folosesc mai multe vase Petri umplute cu un mediu nutritiv dens. O picătură din materialul de testat este plasată pe suprafața mediului. Apoi, folosind o spatulă sterilă, această picătură este distribuită în mediul nutritiv (însămânțarea gazonului).
Semănatul se poate face și prin striare folosind o ansă bacteriologică. Aceeași spatulă sau buclă este folosită pentru a semăna a doua, a treia etc. cupe. De regulă, în prima cană după cultivarea semințelor, creșterea microbiană apare sub forma unui înveliș continuu; în cupele ulterioare, conținutul de microorganisme scade și se formează colonii izolate, din care o cultură pură poate fi ușor izolată prin screening. .
Astfel, in primele sectoare se obtine o crestere continua, iar de-a lungul curselor ulterioare vor creste colonii izolate, reprezentand urmasii unei celule.
Pentru a economisi medii și ustensile, puteți folosi o cană, împărțind-o în sectoare și să le semănați secvențial cu o dâră (metoda depleting streak). Pentru a face acest lucru, luați materialul într-o buclă și trageți o serie de linii paralele cu acesta, mai întâi de-a lungul suprafeței primului sector, apoi însămânțați succesiv toate celelalte sectoare cu celulele rămase pe buclă. Cu fiecare accident vascular cerebral ulterior, numărul de celule însămânțate scade.
Metoda de izolare a culturilor pure cu ajutorul substanțelor chimice folosit pentru izolarea culturilor de microorganisme rezistente la anumite substante chimice. De exemplu, folosind această metodă este posibilă izolarea unei culturi pure de micobacterii tuberculoase care sunt rezistente la acizi, alcalii și alcool. În acest caz, materialul studiat se umple cu o soluție acidă 15% sau antiformină înainte de însămânțare și se păstrează în termostat timp de 3...4 ore. După expunerea la acid sau alcali, celulele bacilului tuberculozei rămân în viață și toate celelalte microorganisme conținute în materialul de testat mor. După neutralizarea acidului sau alcalin, materialul tratat este însămânțat pe mediu solid și se obțin colonii izolate ale agentului patogen al tuberculozei.
77288 0
Proprietățile culturale ale bacteriilor
Proprietățile culturale (sau macromorfologice) includ trăsături caracteristice ale creșterii microorganismelor pe medii nutritive solide și lichide. Pe suprafața mediilor nutritive dense, în funcție de însămânțare, microorganismele pot crește sub formă de colonii, dungi sau gazon continuu.O colonie este o colecție izolată de celule de același tip care au crescut dintr-o celulă (clonă de celule). În funcție de locul unde crește microorganismul (pe suprafața unui mediu nutritiv dens sau în grosimea acestuia), se disting coloniile de suprafață, adânci și de fund.
Coloniile crescute la suprafața mediului sunt diverse: sunt specifice speciei și studiul lor este folosit pentru a determina speciile culturii studiate.
La descrierea coloniilor se iau în considerare următoarele caracteristici:
1) forma coloniei - rotundă, amiboidă, rizoidă, neregulată etc.;
2) dimensiunea (diametrul) coloniei - foarte mică (ascuțită) (0,1-0,5 mm), mică (0,5-3 mm), mijlocie (3-5 mm) și mare (mai mult de 5 mm în diametru);
3) suprafata coloniei este neteda, aspra, pliata, sifonata, cu cercuri concentrice sau striata radial;
4) profil de colonie - plat, convex, în formă de con, în formă de crater etc.;
5) transparență - tern, mat, strălucitor, transparent, pudrat;
6) culoarea coloniei (pigment) - incolor sau pigmentat (alb, galben, auriu, roșu, negru), se remarcă în special eliberarea pigmentului în mediu cu colorarea acestuia;
7) marginea coloniei - netedă, ondulată, zimțată, franjuri etc.;
8) structura coloniei - omogenă, cu granulație fină sau grosieră, striată; se determină marginea și structura coloniei cu o lupă sau la o mărire redusă a unui microscop prin plasarea unei cutii Petri cu inocularea pe masa microscopului cu capacul în jos;
9) consistența coloniei; determinată prin atingerea suprafeței cu o buclă: colonia poate fi densă, moale, în creștere în agar, mucoasă (se întinde în spatele buclei), fragilă (se rupe ușor la contactul cu bucla).
Coloniile adânci arată cel mai adesea ca niște linte mai mult sau mai puțin turtite (formă ovală cu capete ascuțite), uneori bulgări de vată cu excrescențe sub formă de fir în mediul nutritiv. Formarea coloniilor profunde este adesea însoțită de ruperea mediului dens dacă microorganismele eliberează gaz.
Coloniile inferioare arată de obicei ca niște filme subțiri transparente care se răspândesc de-a lungul fundului.
Caracteristicile coloniei se pot modifica odată cu vârsta, depind de compoziția mediului și de temperatura de cultivare.
Creșterea microorganismelor pe medii nutritive lichide este luată în considerare utilizând culturi de patru până la șapte zile crescute în condiții staționare.
În mediile nutritive lichide, odată cu creșterea microorganismelor, se observă turbiditatea mediului și formarea unui film sau sediment.
La creșterea pe medii nutritive semi-lichid (0,5-0,7% agar), microbii mobili provoacă turbiditate pronunțată, formele imobile cresc numai în timpul însămânțării prin injectare în mediu.
Adesea, creșterea microbilor este însoțită de apariția mirosului, pigmentarea mediului și eliberarea de gaze. Mirosul caracteristic culturilor unor tipuri de bacterii este asociat cu formarea diverșilor esteri (acetat de etil, acetat de amil etc.), indol, mercaptan, hidrogen sulfurat, skatol, amoniac, acid butiric.
Capacitatea de a forma pigmenți este inerentă multor tipuri de microorganisme. Natura chimică a pigmenților este diversă: carotenoizi, antociani, melanine. Dacă pigmentul este insolubil în apă, se colorează doar placa de cultură; dacă este solubil, mediul nutritiv devine și el colorat. Se crede că pigmenții protejează bacteriile de efectele nocive ale luminii solare, motiv pentru care există atât de multe bacterii pigmentate în aer; în plus, pigmenții sunt implicați în metabolismul acestor microorganisme.
În natură, există așa-numitele bacterii fosforescente, ale căror culturi strălucesc în întuneric cu o lumină verzuie-albăstruie sau gălbuie. Astfel de bacterii se găsesc în principal în apa de râu sau de mare. Bacteriile luminoase - fotobacterii - includ bacterii aerobe (vibrioni, coci, bastonașe).
Izolarea culturilor pure de microorganisme
O cultură pură este o cultură care conține microorganisme din aceeași specie. Izolarea culturilor pure de bacterii este o etapă obligatorie a cercetării bacteriologice în practica de laborator, în studiul contaminării microbiene a diferitelor obiecte de mediu și, în general, în orice lucru cu microorganisme.Materialul studiat (apă, sol, aer, alimente sau alte obiecte) conține de obicei asociații de microbi.
Izolarea unei culturi pure face posibilă studierea caracteristicilor morfologice, culturale, biochimice, antigenice și a altor caracteristici, a căror totalitate determină specia și tipul agentului patogen, adică se face identificarea acestuia.
Pentru a izola culturile pure de microorganisme, se folosesc metode care pot fi împărțite în mai multe grupuri:
1. Metoda lui Pasteur - diluarea secvenţială a materialului de testat într-un mediu nutritiv lichid până la concentraţia unei celule în volum (are semnificaţie istorică).
2. Metoda Koch („plate wiring”) - diluarea secvenţială a materialului de testat în agar topit (temperatura 48-50 C), urmată de turnare în vase Petri, unde agarul se solidifică. Inoculările se fac, de regulă, din ultimele trei sau patru diluții, unde bacteriile devin puține și mai târziu, pe măsură ce cresc pe cutii Petri, apar colonii izolate, formate dintr-o celulă mamă inițială. Din colonii izolate adânci în agar, se obține o cultură pură de bacterii prin subcultură pe medii proaspete.
3. Metoda Shukevich - folosită pentru a obține o cultură pură de Proteus și alte microorganisme cu creștere „târâtoare”. Materialul de testat este inoculat în apă de condensare la baza oblicului de agar. Microbii mobili (Proteus) sunt capabili să se ridice în sus agar-ul înclinat, formele imobile rămân să crească dedesubt, la locul de însămânțare. Prin reînsămânțarea marginilor superioare ale culturii, puteți obține o cultură pură.
4. Metoda Drigalsky - utilizată pe scară largă în practica bacteriologică, în care materialul studiat este diluat într-o eprubetă cu soluție salină sterilă sau bulion. O picătură de material se adaugă în prima ceașcă și se întinde pe suprafața mediului cu o spatulă de sticlă sterilă. Apoi, cu aceeași spatulă (fără a o arde în flacăra arzătorului), aceeași semănat se face și în a doua și a treia cupă.
Cu fiecare inoculare de bacterii, pe spatulă rămâne din ce în ce mai puțin și, la însămânțarea pe a treia cană, bacteriile vor fi distribuite pe suprafața mediului nutritiv separat una de cealaltă. După 1-7 zile de păstrare a vaselor într-un termostat (în funcție de rata de creștere a microorganismelor), pe al treilea vas, fiecare bacterie produce o clonă de celule, formând o colonie izolată, care este subcultivată pe agar înclinat pentru a se acumula. o cultură pură.
5. Metoda Weinberg. Dificultăți deosebite apar la izolarea culturilor pure de anaerobi obligatorii. Dacă contactul cu oxigenul molecular nu provoacă imediat moartea celulelor, atunci însămânțarea se efectuează conform metodei Drigalsky, dar după aceasta vasele sunt imediat plasate într-un anaerostat. Cu toate acestea, metoda de reproducere este folosită mai des. Esența sa constă în faptul că diluarea materialului studiat se efectuează într-un mediu nutritiv de agar topit și răcit la 45-50 oC.
Se fac 6-10 diluții succesive, apoi mediul din eprubete este răcit rapid și suprafața este acoperită cu un strat dintr-un amestec de parafină și vaselina pentru a împiedica pătrunderea aerului în grosimea mediului nutritiv. Uneori, mediul nutritiv, după însămânțare și amestecare, este transferat în tuburi Burri sterile sau pipete Pasteur capilare, ale căror capete sunt sigilate. Cu o diluare reușită, colonii izolate de anaerobi cresc în eprubete, tuburi Burri și pipete Pasteur. Pentru a se asigura că coloniile izolate sunt clar vizibile, se utilizează medii nutritive clarificate.
Pentru a extrage colonii izolate de anaerobi, tubul este ușor încălzit prin rotirea lui peste o flacără, în timp ce agarul adiacent pereților se topește și conținutul tubului sub forma unei coloane de agar alunecă într-o cutie Petri sterilă. Coloana de agar este tăiată cu pensete sterile și coloniile sunt îndepărtate cu o buclă. Coloniile extrase sunt plasate într-un mediu lichid favorabil dezvoltării microorganismelor izolate. Mediul de agar este suflat din tubul Burri prin trecerea gazului printr-un dop de bumbac.
6. Metoda Hungate. Atunci când doresc să obțină colonii izolate de bacterii cu sensibilitate deosebit de mare la oxigen (aerobi stricti), se folosește metoda tubului rotativ Hungate. Pentru a face acest lucru, mediul de agar topit este inoculat cu bacterii la un curent constant printr-o eprubetă de gaz inert eliberat de impuritățile de oxigen. Tubul este apoi etanșat cu un dop de cauciuc și plasat orizontal într-o clemă care rotește tubul; mediul este distribuit uniform pe pereții eprubetei și se solidifică într-un strat subțire. Utilizarea unui strat subțire într-o eprubetă umplută cu un amestec de gaze permite obținerea de colonii izolate care sunt clar vizibile cu ochiul liber.
7. Izolarea celulelor individuale folosind un micromanipulator. Un micromanipulator este un dispozitiv care vă permite să eliminați o celulă dintr-o suspensie folosind o micropipetă sau microbucla specială. Această operație este controlată la microscop. Pe scena microscopului este instalată o cameră umedă, în care este plasat preparatul de picătură suspendată. Micropipetele (micropoops) sunt fixate în suporturile standurilor de operare, a căror mișcare în câmpul vizual al microscopului se realizează cu precizie micron grație unui sistem de șuruburi și pârghii. Cercetatorul, privind printr-un microscop, indeparteaza celulele individuale cu micropipete si le transfera in tuburi care contin un mediu lichid steril pentru a obtine o clona celulara.
L.V. Timoscenko, M.V. Chubik
Metoda Pasteur Metoda Koch Biologic Fizic
(are istoric (lamelar)
sens) cablare) Metoda chimică a lui Shchukevich
Modern
Semănat cu buclă Semănat cu spatulă
(metoda Drigalski)
Metode de izolare a culturilor pure (Schema 11):
1. Metode de eliberare mecanică se bazează pe separarea microbilor prin frecare secvenţială a materialului de testat pe suprafaţa unui agar.
A) metoda lui Pasteur– are semnificație istorică, prevede diluarea secvențială a materialului de testat într-un mediu nutritiv lichid, utilizând metoda de laminare
b) metoda Koch– metoda plăcii – bazată pe diluarea secvenţială a materialului de testat cu agar peptonă-carne, urmată de turnarea eprubetelor cu materialul diluat în vase Petri
V) metoda Drigalski– la semănat material bogat contaminat cu microfloră, folosiți 2-3 căni pentru semănat secvenţial cu o spatulă.
G) Semănat cu buclă în mișcări paralele.
2. Metode biologice pe baza proprietăților biologice ale agenților patogeni.
A) Biologic– infectarea animalelor foarte sensibile, unde microbii se înmulțesc și se acumulează rapid. În unele cazuri, această metodă este singura care permite izolarea unei culturi a agentului patogen de la o persoană bolnavă (de exemplu, cu tularemie), în alte cazuri este mai sensibilă (de exemplu, izolarea pneumococului la șoarecii albi sau a agentului cauzal). de tuberculoză la cobai).
b) Chimic– bazat pe rezistența la acid a micobacteriilor. Pentru a elibera materialul de flora însoțitoare, acesta
tratat cu soluție acidă. Doar bacilii de tuberculoză vor crește, deoarece microbii rezistenți la acid au murit sub influența acidului.
V) Metoda fizica pe baza rezistenţei sporilor la căldură. Pentru a izola o cultură de bacterii formatoare de spori din
amestecuri, materialul se încălzește la 80°C și se inoculează pe un mediu nutritiv. Doar bacteriile cu spori vor crește, deoarece sporii lor au rămas în viață și au dat naștere creșterii.
G) metoda Shchukevich– se bazează pe mobilitatea ridicată a Proteus vulgaris, capabil să producă creștere târâtoare.
Metoda de reînsămânțare din colonii pe agar înclinat și MPB:
A) Transferarea de la colonii la agar slants
Deschideți ușor capacul vasului, îndepărtați o parte dintr-o colonie separată cu o buclă calcinată și răcită, deschideți o eprubetă cu agar înclinat steril, ținând-o în mâna stângă într-o poziție înclinată, astfel încât să puteți observa suprafața vasului. mediu. Transferați bucla cu cultura în eprubetă fără a atinge pereții, frecați-o peste mediul nutritiv, alunecând de-a lungul suprafeței de la o margine a eprubetei la cealaltă, ridicând loviturile până în partea de sus a mediului - însămânțare cu dungi. Se inchide eprubeta si, fara a se da drumul, se semneaza numele microbului inoculat si data inocularii.
b) Se transferă din colonie în bulion de peptonă de carne
Tehnica de reînsămânțare pe MPB este practic aceeași ca la însămânțarea pe medii solide. La semănat pe MPB, bucla cu materialul de pe ea este scufundată în mediu. Dacă materialul este vâscos și nu poate fi îndepărtat din buclă, este frecat pe peretele vasului și apoi spălat cu un mediu lichid. Materialul lichid, colectat cu o pipetă Pasteur sterilă sau gradată, este turnat în mediul nutritiv.
Ca rezultat al muncii independente, studentul ar trebui să știe:
1. Metode de izolare a unei culturi pure de microorganisme
2. Metode de cultivare a microorganismelor
A fi capabil să:
1. Abilități în respectarea regulilor regimului antiepidemic și a măsurilor de siguranță
2. Dezinfectați materialul, dezinfectați mâinile
3. Pregătiți preparate din colonii bacteriene
4. Colonii de microscopie
5. Microorganisme cu colorație Gram
LECȚIA 8
SUBIECT. Metode de izolare a culturilor pure (continuare). Activitatea enzimatică a bacteriilor și metode de studiere a acesteia.
O cultură pură este o colecție de microorganisme aparținând aceleiași specii. Obținerea acestui material este un punct necesar de cercetare în implementarea tehnicilor de diagnostic de laborator. Pentru a izola culturile pure de bacterii, se folosesc frotiuri din sânge, spută, fecale și se examinează material purulent și alt material biologic. În condiții naturale (aer, apă, sol), produse alimentare și cadavre (umane, animale) există asocieri de diferite tipuri de microorganisme.
Separarea culturii pure este importantă pentru un studiu detaliat al proprietăților microbilor: morfologice, culturale, biochimice și antigenice. Pe baza rezultatelor acestor metode de cercetare se poate stabili că agentul patogen aparține unei anumite specii și tip, cu alte cuvinte, să se efectueze identificarea acestuia.
Principiile separării biologice a bacteriilor presupun luarea în considerare a caracteristicilor activității de viață a microbilor pentru a selecta cele mai optime metode de cercetare. Metodele selectate trebuie să se potrivească cu agentul patogen în funcție de anumiți parametri.
- Tipul de respirație. Dintre bacterii, se disting grupuri de reprezentanți aerobi și anaerobi. Pentru a obține microbi anaerobi, materialul pentru cercetare este încălzit. Următoarea etapă este cultivarea microbilor în condiții anaerobe. Metodele de obținere a bacteriilor aerobe și anaerobe sunt diferite.
- Sporularea. Capacitatea unor bacterii de a forma spori asigură protecția și conservarea microorganismelor.
- Rezistența bacteriilor la efectele agresive ale alcalinelor și acizilor. Rezistența unor tipuri de bacterii la aceste substanțe asigură purificarea maximă a materialului de testat de impuritățile altor bacterii folosind soluții alcaline sau acide.
- Motilitatea organismelor bacteriene. Pentru a separa o cultură pură de microorganisme mobile, se folosesc metode de separare a culturilor microbiene într-o picătură de condensat.
- Sensibilitatea microorganismelor la antibiotice, unele substanțe chimice și alți agenți antimicrobieni. Pentru unii agenți patogeni, cele mai preferate metode pentru izolarea culturilor folosind medii nutritive selective (specifice).
- Antibiotice. Curățați materialul de microorganisme suplimentare.
- Capacitatea bacteriilor de a pătrunde în pielea intactă. Această proprietate este inerentă unor soiuri care au factori de agresiune.
- Sensibilitatea animalelor la unele boli de origine infecțioasă.
Tehnici de evaluare a agenților patogeni
O serie de metode sunt utilizate pentru a obține culturi pure de celule bacteriene. Fiecare dintre ele este utilizat într-o situație particulară și are etape succesive clare de obținere a coloniilor de agent patogen. Să ne uităm la cele mai populare.
tehnica lui Pasteur
Reprezintă diluarea culturilor pure într-un mediu pentru creșterea bacteriană (consistență lichidă) pentru a obține o concentrație de 1 celulă pe volum de lichid. Această metodă de izolare are o mare importanță istorică.
Tehnica Koch
Cunoscută și sub denumirea de tehnică de „cablare a plăcii”. Este o diluție a materialului pentru cercetare în agar (în stare topită la o temperatură de 48-50°C). Apoi, compoziția rezultată este turnată în vase Petri, unde ar trebui să se întărească.
Inoculările se efectuează de obicei din ultimele 3-4 diluții, deoarece există deja puține bacterii acolo. Astfel, atunci când microbii cresc pe un mediu nutritiv, apar colonii izolate de microorganisme, care se nasc dintr-o singură celulă mamă. Apoi puteți selecta o colonie izolată din adâncurile agarului și o puteți transfera într-un mediu nutritiv proaspăt. Următoarea etapă este identificarea și izolarea agentului patogen.
tehnica lui Shukevici
Se utilizează atunci când este necesară izolarea unei culturi pure de aerobi Proteus sau a oricăror alți microbi caracterizați prin creștere „târâtoare”. Semănați culturile în apă condensată la baza oblicului de agar.
Cu această metodă de separare a unei culturi pure, organismele celulare mobile (Proteus) se ridică în partea superioară a oblicului de agar, iar formele imobile nu își schimbă locația pe mediul de inoculare. Prin reînsămânțarea marginilor superioare ale culturii germinate se poate obține o cultură bacteriană pură.
tehnica lui Drigalsky
Metoda Drigalski este folosită pe scară largă în studiul materialului biologic prin diluarea culturilor într-o eprubetă cu bulion sau ser fiziologic.
Următorul pas: o picătură din soluția rezultată este distribuită uniform pe suprafața mediului alimentar din prima cană folosind o spatulă de sticlă sterilă. Apoi, fără să ardă spatula pe foc, o seamănă pe al 2-lea și al 3-lea vas. Esența metodei Drygalsky este că, cu fiecare însămânțare ulterioară a culturilor, concentrația de bacterii (aerobi) devine din ce în ce mai mică. Pe placa a 3-a sunt distribuite destul de separat, fiecare celulă bacteriană dând naștere la celule clonale (sub forma unei colonii izolate). Ele sunt subcultivate pe agar-agar pentru a acumula agenți patogeni.
Tehnica Weinberg
Izolarea culturilor pure de agenți patogeni anaerobi provoacă anumite dificultăți dacă microorganismele nu mor la contactul cu moleculele de oxigen. Esența tehnicii este îndepărtarea microbilor anaerobi (din material) într-un mediu alimentar topit ușor răcit (45-50°C) (agarosat). Se efectuează 6-10 diluții. Apoi urmează următorul pas: este necesar să se răcească rapid compoziția în eprubetă și să se umple suprafața acesteia cu un amestec de vaselină și ulei de parafină, care împiedică pătrunderea aerului și favorizează dezvoltarea condițiilor anaerobe.
Dacă semănatul este favorabil, în a doua zi germinează colonii izolate, care pot fi îndepărtate din eprubetă prin încălzirea acesteia cu un arzător. Din coloana de agar tăiată, culturile sunt colectate folosind o buclă pentru cercetări ulterioare. Coloniile rezultate sunt plasate într-un mediu nutritiv lichid, moment în care etapele de izolare a unei colonii de agenți patogeni anaerobi pot fi finalizate.
Tehnica Hungate
Este adesea folosit pentru a izola microbii aerobi care sunt foarte sensibili la oxigen. Pentru a realiza această izolare a culturii aerobe se folosește tehnica eprubetelor rotative.
Metodele de inoculare a bacteriilor aerobe implică reproducerea lor pe un mediu de agar topit. Prezența unui gaz inert într-o eprubetă face posibilă creșterea coloanelor izolate de bacterii aerobe în așa fel încât culturile aerobe izolate să poată fi văzute clar chiar și cu ochiul liber timp de 2-3 zile.
Micromanipulator
Aceasta este o tehnică pentru izolarea celulelor bacteriene individuale folosind un micromanipulator. Un micromanipulator este un dispozitiv special care poate fi folosit pentru a prinde o celulă dintr-o suspensie și oferă, de asemenea, capacitatea de a inocula cultura într-o eprubetă.
Identificarea ulterioară a agentului patogen se realizează ținând cont de toate proprietățile enumerate ale agentului patogen (aerobi și anaerobi), precum și de caracteristicile interacțiunii lor cu diferite substanțe.
