22. Metódy izolácie čistých kultúr aeróbov.
Proces izolácie čistej kultúry možno rozdeliť do niekoľkých etáp.
Prvé štádium. Zo skúmaného materiálu sa pripraví náter, zafarbí sa Gramovou alebo inou metódou a mikroskopicky sa skopíruje. Na očkovanie sa testovaný materiál v prípade potreby zriedi v skúmavke sterilným izotonickým roztokom chloridu sodného. Jedna kvapka pripraveného riedenia sa nanesie v slučke na povrch živného agaru v Petriho miske a pomocou špachtle sa dôkladne rozotrie do média, pričom sa materiál rovnomerne rozloží po celom jeho povrchu. Po vysiatí sa pohár otočí hore dnom, označí sa a umiestni sa do termostatu pri teplote 37 °C na 18-24 hodín.
Druhá fáza. Prezerajú misky a študujú izolované kolónie, pričom venujú pozornosť ich tvaru, veľkosti, konzistencii a iným vlastnostiam. Na stanovenie morfológie buniek a ich farbiacich vlastností sa pripraví náter z časti študovanej kolónie, zafarbí sa pomocou Grama a podrobí sa mikroskopii. Na izoláciu a akumuláciu čistej kultúry sa jedna izolovaná kolónia alebo niekoľko rôznych izolovaných kolónií subkultivuje do samostatných skúmaviek so šikmým agarom alebo nejakým iným živným médiom. Na tento účel sa časť kolónie odstráni slučkou bez toho, aby sa dotkla susedných kolónií.
Tretia fáza: Zaznamenáva sa rastový vzorec izolovanej čistej kultúry. Vizuálne čistá kultúra sa vyznačuje rovnomerným rastom. Mikroskopické vyšetrenie zafarbeného náteru pripraveného z takejto kultúry odhalí morfologicky a tinctoriálne homogénne bunky. V prípade výrazného polymorfizmu, ktorý je vlastný niektorým typom baktérií, sa však v náteroch z čistej kultúry, spolu s typickými, nachádzajú aj iné bunkové formy.
23. Metódy izolácie čistých kultúr anaeróbov.
Živné pôdy pre anaeróby musia spĺňať tieto základné požiadavky: 1) spĺňať nutričné potreby; 2) zabezpečiť rýchly rast mikroorganizmov; 3) primerane znížiť
Očkovanie za účelom izolácie anaeróbnej mikroflóry, tak spórotvornej (klostridie), ako aj netvoriacej spóry (veillonella, bacteroides, peptokoky), sa uskutočňuje za prísne anaeróbnych podmienok. Primárne inokulácie sa uskutočňujú na obohacovacích médiách (tioglykolát, Kitta - Tarozzi), potom sa subkultivujú na pevnom médiu: cukrový krvný agar v Petriho miskách, vo vysokom stĺpci cukrového živného agaru alebo iného média, aby sa získali izolované kolónie. Po inkubácii plodín v anaeróbnych podmienkach sa z výsledných bakteriálnych kolónií pripravia nátery, zafarbia sa, mikroskopujú a potom sa subkultivujú na Kitt-Tarozziho médiu a agarovom médiu, aby sa izolovala čistá kultúra.
Pri izolácii anaeróbnych baktérií tvoriacich spóry (klostrídie) sa počiatočné inokulácie zahrievajú vo vodnom kúpeli pri teplote 80 °C počas 20 minút, aby sa zničili vegetatívne bunky cudzej mikroflóry, ktoré môžu byť prítomné v testovanom materiáli.
24. Identifikácia mikroorganizmov morfologická, kultúrna sérologická, biologická, genetická.
Identifikácia je určenie systematickej polohy, oddelenie od akéhokoľvek zdroja až po úroveň druhu alebo variantu.
25. Metóda biochemickej identifikácie: stanovenie proteolytických. sacharolytické, lipolytické vlastnosti, identifikácia hemolyzínov a oxidoreduktáz. Použitie automatických mikrobiologických analyzátorov .
Táto metóda zahŕňa štúdium enzymatickej degradácie rôznych substrátov (sacharidy, aminokyseliny a proteíny, močovina, peroxid vodíka atď.) s tvorbou medziproduktov a konečných
Produkty.
Karbohydrázy- enzýmy, ktoré rozkladajú sacharidy. Stanovením karbohydráz, tzv sacharolytické vlastnosti mikróbov. Na tento účel sa používajú tieto médiá:
a) Hiss media (kvapalné a polotekuté s indikátormi). Ako posledné sa používa Andredeovo činidlo, brómtymolová modrá alebo BP Enzymatická aktivita baktérií sa posudzuje podľa zmeny farby média a tvorby plynu;
b) diferenciálne diagnostické médiá s laktózou (Endo, Levina, Ploskireva atď.);
c) polysacharidové médiá (ako Olkenitsky, Kligler atď.).
Proteázy-enzýmy, ktoré rozkladajú bielkoviny:
a) študovaná kultúra môže rozkladať substrátové proteíny za vzniku peptónu, albumínu a aminokyselín. Tento proces sa vyskytuje v dôsledku enzýmov proteináz a peptidáz. Na identifikáciu týchto enzýmov sa študovaná kultúra naočkuje na množstvo médií: zrazená srvátka, stĺpec želatíny (skvapalnenie v pozitívnych prípadoch), mliečny agar v Petriho miske (v pozitívnych prípadoch sa okolo kolónií objavia zóny zákalu) ;
b) rozklad aminokyselín mikróbmi môže nastať prostredníctvom dekarboxylácie alebo deaminácie. V prvom prípade sa z jednej alebo druhej aminokyseliny tvoria amíny, ktoré sa detegujú buď elektroforézou. alebo alkalizáciou média. Prítomnosť deamináz v mikróbe sa posudzuje podľa tvorby amoniaku v médiu v dôsledku procesu deaminácie aminokyselín;
c) rozklad aminokyseliny tryptafán v dôsledku pôsobenia enzýmu tryptafanázy je sprevádzaný tvorbou indolu. Ten sa zisťuje pomocou kúska papiera navlhčeného kyselinou šťaveľovou a fixovaného pod zátkou nad živným médiom. V pozitívnych prípadoch sa kus papiera zmení na červený;
d) na identifikáciu enzýmov na štiepenie aminokyselín obsahujúcich síru (cystín, cysteín) sa vykonávajú testy na H2S, ako produkt štiepenia týchto aminokyselín desulfurázami. Prítomnosť H2S sa zisťuje aj v prostredí Olkenitského;
e) na identifikáciu ureázy sa do živného média pri neutrálnom pH pridá enzým, ktorý štiepi močovinu, močovinu a indikátor. V pozitívnych prípadoch médium mení farbu v dôsledku posunu pH na alkalickú stranu v dôsledku tvorby amoniaku. Lipázy- enzýmy na rozklad lipidov a lipoidov. Najčastejšie sa lecitináza stanovuje nanesením na žĺtkový agar. Lecitináza rozkladá lecitín na fosfocholín a diglycerid. V týchto prípadoch, keď kolónie rastú, okolo nich sa objavujú opalescentné zóny, ktoré odrážajú aktivitu lecitinázy.
Toxínové enzýmy : Hemolyzíny sú enzýmy, ktoré rozkladajú fosfolipidovú membránu erytrocytov. Zisťujú sa naočkovaním kultúry na krvný agar (5-10 %). Rozlišujú sa b-hemolýza alebo úplná hemolýza, keď sa okolo kolónií vytvoria čistiace zóny, a-hemolýza, neúplná hemolýza, keď sú okolo kolónií zelené zóny. Neprítomnosť hemolýzy sa označuje ako d-hemolýza.
Cytotoxíny- enzýmy, ktoré majú toxický účinok na cieľové bunky. Napríklad cytotoxicita toxínu anaeróbnych mikroorganizmov sa stanovuje v bunkovej kultúre. Na tento účel sa 1 g materiálu (stolice alebo iného) zriedi vo fosfátovom tlmivom roztoku v pomere 1:10 hmotnosť/objem a centrifuguje sa 30 minút pri 4000 ot./min. Supernatant sa prefiltruje na 20 nm filtri, pridá sa k monovrstve bunkovej kultúry McCoy a inkubuje sa pri 37 °C počas 24-48 hodín, kým sa nedosiahne toxický účinok.
Imunochemické stanovenie produkcie toxínov: na stanovenie mnohých exotoxínov - záškrtu, cholery, stafylokokov atď. sa spravidla používa enzýmová imunosorbentná metóda. Na tento účel sa používajú testovacie systémy na báze monoklonálnych protilátok proti špecifickému exotoxínu.
Pasmokoaguláza- enzým, ktorý zráža krvnú plazmu zvierat. Stanovené v skúmavkovej reakcii. V 1 ml králičej alebo ľudskej citrátovej plazmy (celej alebo zriedenej 2 a 4 krát fyziologickým roztokom) sa premieša slučka dennej agarovej kultúry mikróbov. Zmes sa inkubuje v termostate pri 37 °C. V pozitívnych prípadoch po 2-4 hodinách plazma koaguluje (objaví sa zrazenina). Lecitináza - pozri vyššie.
Oxidové reduktázy:
1. Definícia oxidázy. Prúžky testovanej kultúry sa aplikujú v slučke na filtračný papier navlhčený 1 % roztokom tetrametylparafenyléndiamínu. V pozitívnom prípade sa objaví fialové sfarbenie pruhov (do 1 min).
2. Stanovenie katalázy. Na podložné sklíčko sa nanesie kvapka 3 % roztoku peroxidu vodíka a zavedie sa tam slučka testovacej kultúry. V prítomnosti katalázy sa tvoria bubliny kyslíka.
3. Stanovenie dehydráz. Prítomnosť dehydráz sa posudzuje podľa redukčnej schopnosti mikróba, t.j. schopnosť redukovať niektoré organické farbivá (napríklad 1% vodný roztok metylénovej modrej). Do stĺpca cukrového agaru (donor vodíka) sa pridá farbivo (akceptor vodíka) a mikrobiálna kultúra sa naočkuje injekciou. V pozitívnych prípadoch mikrób rastúci na takomto médiu odfarbí.
4. Stanovenie spektra mastných kyselín s krátkym reťazcom (SCFA), Anaeróbne mikroorganizmy produkujú medziprodukty, medzi ktoré patria mastné kyseliny s krátkym reťazcom a alkoholy, ktorých spektrum (profil) je u rôznych typov mikroorganizmov rozdielne a umožňuje identifikáciu mikroorganizmov na úrovni rodu. Najčastejšie sa testujú kyseliny octová, propiónová, butylová, izobutylová, valérová, izovalérová, kaprónová a izokaprónová. Na stanovenie SCFA sa používa metóda plynovej kvapalinovej chromatografie. Identifikujú sa mikroorganizmy, ako sú aktinomycéty, prolionibaktérie, eubaktérie, bifidobaktérie a klostrídie.
Bakteriologické laboratóriá v posledných rokoch používajú komerčné testovacie systémy na rýchlu biochemickú identifikáciu (stanovujúce biochemickú aktivitu rôznych skupín mikroorganizmov): napríklad 2O testy na enterobaktérie a ZO testy na anaeróby. Identifikačná schéma zahŕňa nasledujúce kroky:
Kolónie ---- Príprava ---- Aplikácia ----- Inkubácia ---- Účtovanie (+ -) ---- Inter-
suspenzie suspenzie 4 hodiny 37°C prezentácia v stredu
Ako identifikačný materiál sa používa dobre izolovaná kolónia na platni alebo čistá kultúra v skúmavke, z ktorej sa pripraví suspenzia v koncentrácii štandardu optickej hustoty N4, potom sa do jamiek pridá 55 μl suspenzie. s médiami tohto testovacieho systému. Platňa s prúžkami sa inkubuje pri 37 °C počas 4 hodín. Účtovanie môže prebiehať automaticky (pomocou ATV zariadenia) alebo vizuálne.Výsledok biochemickej reakcie sa vyhodnotí v tvare „+“ alebo „-“ a zapíše sa referenčná tabuľka, do ktorej kladný výsledok zodpovedá číselnému vyjadreniu výsledkom je určitý číselný profil zodpovedajúci špeciálne vyvinutému indexu analytického profilu, ktorý vám umožňuje rýchlo identifikovať jeden alebo druhý
mikroorganizmus.
Pasteurova metóda (metóda limitného riedenia). Pozostáva z vytvorenia série postupných riedení zo študovaného materiálu v tekutom živnom médiu. K tomu sa do skúmavky so sterilným tekutým médiom zavedie kvapka inokula, kvapka z nej sa prenesie do ďalšej skúmavky a takto sa naočkuje až 8...10 skúmaviek. Každým riedením sa počet mikrobiálnych buniek vstupujúcich do média zníži a je možné získať také riedenie, v ktorom v celej skúmavke s médiom bude len jedna mikrobiálna bunka, z ktorej bude čistá kultúra mikroorganizmu rozvíjať. Keďže mikróby rastú v tekutých médiách difúzne, t.j. sa ľahko distribuujú v prostredí, je ťažké izolovať jednu mikrobiálnu bunku od druhej. Pasteurova metóda teda nie vždy poskytuje čistú kultúru. Preto sa v súčasnosti táto metóda používa najmä na predbežné zníženie koncentrácie mikroorganizmov v materiáli pred jeho naočkovaním do pevného média na získanie izolovaných kolónií.
Metódy mechanickej separácie mikroorganizmov pomocou pevných živných médií. Medzi takéto metódy patrí Kochova metóda a Drigalského metóda.
Kochova metóda (metóda hlbokého výsevu). Testovaný materiál sa zavedie bakteriologickou slučkou alebo Pasteurovou pipetou do skúmavky s roztaveným hustým živným médiom. Obsah skúmavky rovnomerne premiešajte otáčaním medzi dlaňami. Kvapka zriedeného materiálu sa prenesie do druhej skúmavky, z druhej do tretej atď. Obsah každej skúmavky, počnúc od prvej, sa naleje do sterilných Petriho misiek. Po stuhnutí média v miskách sa tieto umiestnia do termostatu na kultiváciu.
Na izoláciu anaeróbnych mikroorganizmov pomocou Kochovej metódy je potrebné obmedziť prístup kyslíka ku kultúre. Na tento účel sa povrch hlbokého výsevu v Petriho miske naplní sterilnou zmesou parafínu a vazelíny (1:1). Môžete tiež nechať inokulum dôkladne premiešané s agarovým médiom priamo v skúmavke. V tomto prípade sa vatová zátka nahradí gumenou alebo sa povrch agaru naplní zmesou parafínu a vazelíny. Na extrakciu narastených kolónií anaeróbnych mikroorganizmov sa skúmavky mierne zahrejú rýchlym otáčaním nad plameňom horáka. Agar priľahlý k stenám sa roztopí a stĺpec ľahko vkĺzne do pripravenej Petriho misky. Potom sa agarový stĺpec nareže sterilným skalpelom, kolónie sa odstránia sterilnou slučkou alebo sterilným kapilárnym rezačom a prenesú sa do tekutého média.
Drigalského metóda je založená na mechanickej separácii mikrobiálnych buniek na povrchu hustého živného média v Petriho miskách. Každá mikrobiálna bunka, ktorá sa fixuje na určitom mieste, sa začína množiť a vytvára kolóniu.
Na siatie metódou Drygalsky sa používa niekoľko Petriho misiek naplnených hustým živným médiom. Kvapka testovaného materiálu sa umiestni na povrch média. Potom sa pomocou sterilnej špachtle táto kvapka rozdelí do celého živného média (výsev trávnika).
Výsev možno vykonať aj pruhovaním pomocou bakteriologickej slučky. Rovnaká lopatka alebo slučka sa používa na zasiatie druhej, tretej atď. poháre. Spravidla sa v prvom pohári po kultivácii semena objaví mikrobiálny rast vo forme súvislého povlaku, v ďalších pohároch sa obsah mikroorganizmov znižuje a vytvárajú sa izolované kolónie, z ktorých je možné jednoducho izolovať čistú kultúru preosievaním. .
V prvých sektoroch sa teda dosiahne kontinuálny rast a počas nasledujúcich ťahov budú rásť izolované kolónie, ktoré predstavujú potomstvo jednej bunky.
Aby ste ušetrili médiá a náčinie, môžete použiť jednu šálku, rozdeliť ju na sektory a postupne ich zasiať pruhom (metóda vyčerpania pruhov). Aby ste to urobili, vezmite materiál do slučky a nakreslite s ním sériu paralelných ťahov, najprv pozdĺž povrchu prvého sektora, a potom postupne nasejte všetky ostatné sektory s bunkami zostávajúcimi na slučke. S každým ďalším úderom sa počet nasadených buniek znižuje.
Spôsob izolácie čistých kultúr pomocou chemikálií používa sa na izoláciu kultúr mikroorganizmov odolných voči určitým chemikáliám. Napríklad pomocou tejto metódy je možné izolovať čistú kultúru tuberkulóznych mykobaktérií, ktoré sú odolné voči kyselinám, zásadám a alkoholu. V tomto prípade sa skúmaný materiál pred výsevom naplní 15% roztokom kyseliny alebo antiformínom a udržiava sa v termostate 3...4 hodiny. Po vystavení kyselinám alebo zásadám zostávajú bunky tuberkulózneho bacila živé a všetky ostatné mikroorganizmy obsiahnuté v testovanom materiáli odumierajú. Po neutralizácii kyseliny alebo zásady sa ošetrený materiál vyseje na pevné médium a získajú sa izolované kolónie patogénu tuberkulózy.
77288 0
Kultúrne vlastnosti baktérií
Kultúrne (alebo makromorfologické) vlastnosti zahŕňajú charakteristické znaky rastu mikroorganizmov na pevných a tekutých živných pôdach. Na povrchu hustých živných pôd môžu v závislosti od výsevu rásť mikroorganizmy vo forme kolónií, pruhov alebo súvislého trávnika.Kolónia je izolovaná zbierka buniek rovnakého typu, ktoré vyrástli z jednej bunky (klon buniek). V závislosti od toho, kde mikroorganizmus rastie (na povrchu hustého živného média alebo v jeho hrúbke), sa rozlišujú povrchové, hlboké a spodné kolónie.
Kolónie pestované na povrchu média sú rôznorodé: sú druhovo špecifické a ich štúdium sa používa na určenie druhu skúmanej plodiny.
Pri opise kolónií sa berú do úvahy tieto charakteristiky:
1) tvar kolónie - okrúhly, améboidný, rizoidný, nepravidelný atď.;
2) veľkosť (priemer) kolónie - veľmi malá (špicatá) (0,1-0,5 mm), malá (0,5-3 mm), stredne veľká (3-5 mm) a veľká (priemer viac ako 5 mm);
3) povrch kolónie je hladký, drsný, zložený, zvrásnený, so sústrednými kruhmi alebo radiálne pruhovaný;
4) profil kolónie - plochý, konvexný, kužeľovitý, kráterovitý atď.;
5) transparentnosť - matná, matná, lesklá, transparentná, prášková;
6) farba kolónie (pigment) - bezfarebná alebo pigmentovaná (biela, žltá, zlatá, červená, čierna), najmä si všimnite uvoľňovanie pigmentu do média s jeho sfarbením;
7) okraj kolónie - hladký, zvlnený, zubatý, strapcovitý atď.;
8) štruktúra kolónie - homogénna, jemne alebo hrubozrnná, pruhovaná; okraj a štruktúra kolónie sa určí pomocou lupy alebo pri malom zväčšení mikroskopu umiestnením Petriho misky s inokuláciou na stolík mikroskopu s vekom dole;
9) konzistencia kolónie; určuje sa dotykom povrchu slučkou: kolónia môže byť hustá, mäkká, prerastajúca do agaru, hlienovitá (natiahne sa za slučku), krehká (ľahko sa zlomí pri kontakte so slučkou).
Hlboké kolónie najčastejšie vyzerajú ako viac-menej sploštené lentilky (oválneho tvaru so zahrotenými koncami), niekedy hrudky vaty s niťovitými výrastkami do živného média. Tvorba hlbokých kolónií je často sprevádzaná prasknutím hustého média, ak mikroorganizmy uvoľňujú plyn.
Spodné kolónie zvyčajne vyzerajú ako tenké priehľadné filmy šíriace sa pozdĺž dna.
Charakteristiky kolónie sa môžu vekom meniť, závisia od zloženia média a kultivačnej teploty.
Rast mikroorganizmov na tekutých živných médiách sa berie do úvahy pri použití štvor- až sedemdňových kultúr pestovaných v stacionárnych podmienkach.
V tekutých živných médiách sa s rastom mikroorganizmov pozoruje zakalenie média a tvorba filmu alebo sedimentu.
Pri pestovaní na polotekutých (0,5-0,7 % agar) živných pôdach spôsobujú mobilné mikróby výrazný zákal, imobilné formy rastú len pri výseve injekciou do média.
Rast mikróbov je často sprevádzaný výskytom zápachu, pigmentáciou prostredia a uvoľňovaním plynu. Charakteristický zápach kultúr niektorých druhov baktérií je spojený s tvorbou rôznych esterov (etylacetát, amylacetát a pod.), indolu, merkaptánu, sírovodíka, skatolu, amoniaku, kyseliny maslovej.
Schopnosť tvoriť pigmenty je vlastná mnohým typom mikroorganizmov. Chemická povaha pigmentov je rôznorodá: karotenoidy, antokyány, melaníny. Ak je pigment nerozpustný vo vode, zafarbí sa iba kultúrny plak; ak je rozpustný, sfarbí sa aj živná pôda. Predpokladá sa, že pigmenty chránia baktérie pred škodlivými účinkami slnečného žiarenia, a preto je vo vzduchu toľko pigmentovaných baktérií, navyše sa pigmenty podieľajú na metabolizme týchto mikroorganizmov.
V prírode existujú takzvané fosforeskujúce baktérie, ktorých kultúry v tme žiaria zelenkavo-modravým alebo žltkastým svetlom. Takéto baktérie sa nachádzajú najmä v riečnej alebo morskej vode. Svetelné baktérie – fotobaktérie – zahŕňajú aeróbne baktérie (vibriá, koky, tyčinky).
Izolácia čistých kultúr mikroorganizmov
Čistá kultúra je kultúra, ktorá obsahuje mikroorganizmy rovnakého druhu. Izolácia čistých kultúr baktérií je povinnou etapou bakteriologického výskumu v laboratórnej praxi, pri štúdiu mikrobiálnej kontaminácie rôznych objektov životného prostredia a vo všeobecnosti pri akejkoľvek práci s mikroorganizmami.Študovaný materiál (voda, pôda, vzduch, potraviny alebo iné predmety) zvyčajne obsahuje asociácie mikróbov.
Izolácia čistej kultúry umožňuje študovať morfologické, kultúrne, biochemické, antigénne a iné charakteristiky, ktorých súhrn určuje druh a typ patogénu, t.j. vykonáva sa jeho identifikácia.
Na izoláciu čistých kultúr mikroorganizmov sa používajú metódy, ktoré možno rozdeliť do niekoľkých skupín:
1. Pasteurova metóda - postupné riedenie testovaného materiálu v tekutom živnom médiu na koncentráciu jednej bunky v objeme (má historický význam).
2. Kochova metóda („platne wire“) - postupné riedenie testovaného materiálu v roztavenom agare (teplota 48-50 C), po ktorom nasleduje naliatie do Petriho misiek, kde agar stuhne. Očkovanie sa robí spravidla z posledných troch alebo štyroch riedení, kde je baktérií málo a neskôr, keď rastú na Petriho miskách, vznikajú izolované kolónie, tvorené z jednej počiatočnej materskej bunky. Z izolovaných kolónií hlboko v agare sa získa čistá kultúra baktérií subkultiváciou na čerstvom médiu.
3. Shukevichova metóda - používa sa na získanie čistej kultúry Proteus a iných mikroorganizmov s „plazivým“ rastom. Testovaný materiál sa naočkuje do kondenzovanej vody na spodku šikmého agaru. Mobilné mikróby (Proteus) sú schopné stúpať po šikmom agare, nehybné formy zostávajú rásť dole, v mieste výsevu. Presadením horných okrajov kultúry môžete získať čistú kultúru.
4. Drigalského metóda - široko používaná v bakteriologickej praxi, pri ktorej sa skúmaný materiál zriedi v skúmavke so sterilným soľným roztokom alebo vývarom. Jedna kvapka materiálu sa pridá do prvého pohára a sterilnou sklenenou špachtľou sa rozotrie po povrchu média. Potom tou istou špachtľou (bez toho, aby ste ju spálili v plameni horáka), sa rovnaký výsev vykoná v druhom a treťom pohári.
S každým naočkovaním baktérií zostáva na lopatke stále menej a menej a pri výseve do tretieho pohára sa baktérie rozložia po povrchu živnej pôdy oddelene jedna od druhej. Po 1-7 dňoch udržiavania misiek v termostate (v závislosti od rýchlosti rastu mikroorganizmov) na tretej miske každá baktéria produkuje klon buniek, tvoriacich izolovanú kolóniu, ktorá sa subkultivuje na šikmom agare, aby sa akumulovala čistá kultúra.
5. Weinbergova metóda. Osobitné ťažkosti vznikajú pri izolácii čistých kultúr obligátnych anaeróbov. Ak kontakt s molekulárnym kyslíkom nespôsobí okamžite bunkovú smrť, potom sa očkovanie uskutoční podľa Drigalského metódy, ale potom sa misky okamžite umiestnia do anaerostatu. Častejšie sa však používa spôsob chovu. Jeho podstata spočíva v tom, že riedenie skúmaného materiálu prebieha v roztavenom a ochladenom na 45-50 oC agarovom živnom médiu.
Urobí sa 6-10 postupných riedení, potom sa médium v skúmavkách rýchlo ochladí a povrch sa pokryje vrstvou zmesi parafínu a vazelíny, aby sa zabránilo prenikaniu vzduchu do hrúbky živného média. Niekedy sa živné médium po zasiatí a premiešaní prenesie do sterilných Burri skúmaviek alebo kapilárnych Pasteurových pipiet, ktorých konce sú utesnené. Po úspešnom zriedení rastú izolované kolónie anaeróbov v skúmavkách, skúmavkách Burri a Pasteurových pipetách. Aby boli izolované kolónie jasne viditeľné, používajú sa vyčírené živné pôdy.
Na extrakciu izolovaných kolónií anaeróbov sa skúmavka mierne zahreje otáčaním nad plameňom, pričom sa agar susediaci so stenami roztopí a obsah skúmavky vo forme agarového stĺpca sa vysunie do sterilnej Petriho misky. Agarový stĺpec sa odreže sterilnou pinzetou a kolónie sa odstráni slučkou. Extrahované kolónie sa umiestnia do tekutého média priaznivého pre vývoj izolovaných mikroorganizmov. Agarové médium sa vyfúkne zo skúmavky Burri prechodom plynu cez bavlnenú zátku.
6. Hungate metóda. Keď chcú získať izolované kolónie baktérií s obzvlášť vysokou citlivosťou na kyslík (prísne aeróby), používa sa metóda rotujúcej trubice Hungate. Na tento účel sa roztavené agarové médium naočkuje baktériami konštantným prúdom cez skúmavku s inertným plynom zbaveným kyslíkových nečistôt. Rúrka je potom utesnená gumovou zátkou a umiestnená vodorovne do svorky, ktorá otáča rúrku; médium sa rovnomerne rozloží po stenách skúmavky a stuhne do tenkej vrstvy. Použitie tenkej vrstvy v skúmavke naplnenej zmesou plynov umožňuje získať izolované kolónie, ktoré sú jasne viditeľné voľným okom.
7. Izolácia jednotlivých buniek pomocou mikromanipulátora. Mikromanipulátor je zariadenie, ktoré umožňuje odobrať jednu bunku zo suspenzie pomocou špeciálnej mikropipety alebo mikroslučky. Táto operácia je kontrolovaná pod mikroskopom. Na stolíku mikroskopu je inštalovaná vlhká komora, do ktorej je umiestnený závesný kvapkový prípravok. V držiakoch operačných stojanov sú upevnené mikropipety (micropoops), ktorých pohyb v zornom poli mikroskopu sa vďaka systému skrutiek a pák uskutočňuje s mikrónovou presnosťou. Výskumník pri pohľade cez mikroskop odoberie jednotlivé bunky mikropipetami a prenesie ich do skúmaviek obsahujúcich sterilné tekuté médium, aby získal bunkový klon.
L.V. Timoščenko, M.V. Čubik
Pasteurova metóda Kochova metóda Biologická Fyzikálna
(má historické (lamelové)
význam) vedenie) Chemická metóda Ščukeviča
Moderné
Výsev so slučkou Výsev s lopatkou
(Drigalského metóda)
Metódy izolácie čistých kultúr (schéma 11):
1. Metódy mechanického uvoľňovania sú založené na separácii mikróbov postupným trením testovaného materiálu po povrchu agaru.
A) Pasteurova metóda– má historický význam, umožňuje postupné riedenie testovaného materiálu v tekutom živnom médiu metódou valcovania
b) Kochova metóda– tanierová metóda – založená na postupnom riedení testovaného materiálu mäsovo-peptónovým agarom, po ktorom nasleduje nalievanie skúmaviek so zriedeným materiálom do Petriho misiek
V) Drigalského metóda– pri výseve materiálu bohato kontaminovaného mikroflórou použite 2-3 šálky na sekvenčný výsev stierkou.
G) Výsev so slučkou v paralelných ťahoch.
2. Biologické metódy na základe biologických vlastností patogénov.
A) Biologické– infekcia vysoko citlivých zvierat, kde sa mikróby rýchlo množia a hromadia. V niektorých prípadoch je táto metóda jediná, ktorá umožňuje izolovať kultúru patogénu od chorého človeka (napríklad s tularémiou), v iných prípadoch je citlivejšia (napríklad izolácia pneumokoka u bielych myší alebo pôvodcu ochorenia tuberkulózy u morčiat).
b) Chemický– na základe odolnosti mykobaktérií voči kyselinám. Aby sa materiál oslobodil od sprievodnej flóry, to
ošetrené roztokom kyseliny. Rastú len bacily tuberkulózy, pretože mikróby odolné voči kyselinám zomreli pod vplyvom kyseliny.
V) Fyzikálna metóda na základe odolnosti spór voči teplu. Na izoláciu kultúry spórotvorných baktérií z
Zmesi sa materiál zahreje na 80 °C a naočkuje sa na živné médium. Rastú iba spórové baktérie, pretože ich spóry zostali nažive a vyvolali rast.
G) Metóda Shchukevich– je založená na vysokej pohyblivosti Proteus vulgaris, ktorá je schopná produkovať plazivý rast.
Spôsob opätovného výsevu z kolónií na šikmý agar a MPB:
A) Prenos z kolónií na šikmý agar
Mierne otvorte veko misky, vyberte časť oddelenej kolónie kalcinovanou, vychladenou slučkou, otvorte skúmavku so sterilným šikmým agarom, držte ju v ľavej ruke v naklonenej polohe, aby ste mohli pozorovať povrch misky. stredná. Preneste slučku s kultúrou do skúmavky bez toho, aby ste sa dotkli stien, potierajte ju živným médiom, posúvajte sa po povrchu od jedného okraja skúmavky k druhému, zdvihnite ťahy na vrch média - šúľkovanie. Skúmavka sa uzavrie a bez pustenia sa podpíše názov inokulovaného mikróbu a dátum očkovania.
b) Presun z kolónie do mäsovo-peptónového vývaru
Technika dosevu na MPB je v podstate rovnaká ako pri sejbe na pevné médiá. Pri výseve na MPB sa slučka s materiálom ponorí do média. Ak je materiál viskózny a nedá sa odstrániť zo slučky, rozotrie sa na stenu nádoby a potom sa zmyje tekutým médiom. Kvapalný materiál zozbieraný sterilnou Pasteurovou alebo odmernou pipetou sa naleje do živného média.
V dôsledku samostatnej práce by mal študent vedieť:
1. Spôsoby izolácie čistej kultúry mikroorganizmov
2. Spôsoby kultivácie mikroorganizmov
Byť schopný:
1. Zručnosti v dodržiavaní pravidiel protiepidemického režimu a bezpečnostných opatrení
2. Dezinfikujte materiál, dezinfikujte ruky
3. Pripravte prípravky z kolónií baktérií
4. Mikroskopické kolónie
5. Mikroorganizmy podľa Grama
LEKCIA 8
PREDMET. Metódy izolácie čistých kultúr (pokračovanie). Enzymatická aktivita baktérií a metódy jej štúdia.
Čistá kultúra je súbor mikroorganizmov patriacich k rovnakému druhu. Získanie tohto materiálu je nevyhnutným bodom výskumu pri implementácii laboratórnych diagnostických techník. Na izoláciu čistých kultúr baktérií sa používajú nátery z krvi, spúta, výkalov a skúma sa hnisavý a iný biologický materiál. V prírodných podmienkach (vzduch, voda, pôda), potravinové produkty a mŕtvoly (človek, zviera) existujú asociácie rôznych druhov mikroorganizmov.
Separácia čistej kultúry je dôležitá pre podrobné štúdium vlastností mikróbov: morfologických, kultúrnych, biochemických a antigénnych. Na základe výsledkov týchto výskumných metód je možné stanoviť, že patogén patrí k určitému druhu a typu, inými slovami, vykonať jeho identifikáciu.
Princípy biologickej separácie baktérií zahŕňajú zohľadnenie charakteristík životnej aktivity mikróbov s cieľom vybrať najoptimálnejšie metódy výskumu. Vybrané metódy sa musia zhodovať s patogénom podľa určitých parametrov.
- Typ dýchania. Medzi baktériami sa rozlišujú skupiny aeróbnych a anaeróbnych zástupcov. Na získanie anaeróbnych mikróbov sa materiál na výskum zahrieva. Ďalšou fázou je kultivácia mikróbov v anaeróbnych podmienkach. Spôsoby získavania aeróbnych a anaeróbnych baktérií sú rôzne.
- Sporulácia. Schopnosť niektorých baktérií vytvárať spóry poskytuje ochranu a konzerváciu mikroorganizmov.
- Odolnosť baktérií voči agresívnym účinkom zásad a kyselín. Odolnosť niektorých druhov baktérií voči týmto látkam zaisťuje maximálne čistenie testovaného materiálu od nečistôt iných baktérií pomocou zásaditých alebo kyslých roztokov.
- Pohyblivosť bakteriálnych organizmov. Na separáciu čistej kultúry pohyblivých mikroorganizmov sa používajú metódy separácie mikrobiálnych kultúr v kvapke kondenzátu.
- Citlivosť mikroorganizmov na antibiotiká, niektoré chemikálie a iné antimikrobiálne látky. Pre niektoré patogény sú najvýhodnejšie metódy izolácie kultúr pomocou selektívnych (špecifických) živných médií.
- Antibiotiká. Očistite materiál od ďalších mikroorganizmov.
- Schopnosť baktérií preniknúť do neporušenej kože. Táto vlastnosť je vlastná niektorým odrodám, ktoré majú agresívne faktory.
- Citlivosť zvierat na niektoré choroby infekčného pôvodu.
Techniky hodnotenia patogénov
Na získanie čistých kultúr bakteriálnych buniek sa používa množstvo metód. Každý z nich sa používa v konkrétnej situácii a má po sebe nasledujúce jasné štádiá získavania kolónií patogénu. Pozrime sa na tie najpopulárnejšie.
Pasteurova technika
Predstavuje riedenie čistých kultúr v médiu pre rast baktérií (kvapalná konzistencia) na získanie koncentrácie 1 bunka na objem kvapaliny. Tento spôsob izolácie má veľký historický význam.
Kochova technika
Tiež známa ako technika „doskového zapojenia“. Ide o riedenie materiálu pre výskum v agare (v roztavenom stave pri teplote 48-50°C). Potom sa výsledná kompozícia naleje do Petriho misiek, kde by mala stuhnúť.
Očkovanie sa zvyčajne vykonáva z posledných 3-4 riedení, pretože tam je už málo baktérií. Keď mikróby rastú na živnom médiu, objavujú sa izolované kolónie mikroorganizmov, ktoré sa rodia z jednej materskej bunky. Potom môžete vybrať izolovanú kolóniu z hĺbky agaru a preniesť ju do čerstvého živného média. Ďalšou fázou je identifikácia a izolácia patogénu.
Shukevičova technika
Používa sa, keď je potrebné izolovať čistú kultúru aeróbov Proteus alebo akýchkoľvek iných mikróbov charakterizovaných „plazivým“ rastom. Kultúry zasiate do vody kondenzovanej na spodnej časti agaru.
Pri tomto spôsobe separácie čistej kultúry sa pohyblivé bunkové organizmy (Proteus) zdvihnú na vrchol šikmého agaru a imobilné formy nemenia svoje umiestnenie na očkovacom médiu. Opätovným nasadením horných okrajov naklíčenej kultúry je možné získať čistú bakteriálnu kultúru.
Drigalského technika
Drigalského metóda je pomerne široko používaná pri štúdiu biologického materiálu riedením kultúr v skúmavke bujónom alebo fyziologickým roztokom.
Ďalší krok: jedna kvapka výsledného roztoku sa pomocou sterilnej sklenenej špachtle rovnomerne rozdelí po povrchu potravinového média v 1. pohári. Potom, bez toho, aby spálili lopatku na ohni, zasiali ju na 2. a 3. misu. Podstatou Drygalského metódy je, že s každým ďalším výsevom plodín sa koncentrácia baktérií (aeróbov) znižuje a znižuje. Na 3. platni sú rozmiestnené celkom oddelene, pričom z každej bakteriálnej bunky vznikajú klonálne bunky (vo forme izolovanej kolónie). Sú subkultivované na šikmom agare, aby sa akumulovali patogény.
Weinbergova technika
Izolácia čistých kultúr anaeróbnych patogénov spôsobuje určité ťažkosti, ak mikroorganizmy nezahynú pri kontakte s molekulami kyslíka. Podstatou techniky je odstránenie anaeróbnych mikróbov (v materiáli) v mierne ochladenom (45-50°C) roztavenom potravinárskom médiu (agarózovanom). Uskutoční sa 6-10 riedení. Potom prichádza ďalší krok: je potrebné rýchlo ochladiť kompozíciu v skúmavke a naplniť jej povrch zmesou vazelíny a parafínového oleja, ktorá zabraňuje prenikaniu vzduchu a podporuje rozvoj anaeróbnych podmienok.
Ak je výsev priaznivý, na druhý deň vyklíčia izolované kolónie, ktoré je možné zo skúmavky vybrať zahriatím na horáku. Z narezaného agarového stĺpca sa kultúry zbierajú pomocou slučky na ďalší výskum. Výsledné kolónie sa umiestnia do tekutého živného média, v tomto bode môžu byť dokončené fázy izolácie kolónie anaeróbnych patogénov.
Hungate technika
Často sa používa na izoláciu aeróbnych mikróbov, ktoré sú vysoko citlivé na kyslík. Na uskutočnenie tejto izolácie aeróbnej kultúry sa používa technika rotujúcich skúmaviek.
Spôsoby inokulácie aeróbnych baktérií zahŕňajú ich rozmnožovanie na roztavenom agarovom médiu. Prítomnosť inertného plynu v skúmavke umožňuje pestovať izolované stĺpce aeróbnych baktérií takým spôsobom, že izolované aeróbne kultúry sú zreteľne viditeľné aj voľným okom počas 2-3 dní.
Mikromanipulátor
Ide o techniku izolácie jednotlivých bakteriálnych buniek pomocou mikromanipulátora. Mikromanipulátor je špeciálne zariadenie, ktoré možno použiť na zachytenie jednej bunky zo suspenzie a tiež poskytnúť možnosť naočkovať kultúru do skúmavky.
Ďalšia identifikácia patogénu sa vykonáva s prihliadnutím na všetky uvedené vlastnosti patogénu (aeróby a anaeróby), ako aj charakteristiky ich interakcie s rôznymi látkami.
