22. Metode za izolacijo čistih kultur aerobov.
Postopek izolacije čiste kulture lahko razdelimo na več stopenj.
Prva stopnja. Iz preiskovanega materiala pripravimo bris, ga obarvamo po Gramu ali drugi metodi in mikroskopiramo. Za inokulacijo se preskusni material po potrebi razredči v epruveti s sterilno izotonično raztopino natrijevega klorida. Eno kapljico pripravljene razredčine v zanki nanesemo na površino hranilnega agarja v petrijevki in previdno vtremo v medij z lopatko, tako da material enakomerno porazdelimo po celotni površini. Po setvi skodelico obrnemo na glavo, podpišemo in postavimo v termostat pri temperaturi 37 ° C 18-24 ur.
Druga faza. Pregledujejo posode in preučujejo izolirane kolonije, pri čemer so pozorni na njihovo obliko, velikost, konsistenco in druge znake. Za določitev morfologije celic in njihovih tinktorialnih lastnosti pripravimo razmaz iz dela proučevane kolonije, obarvamo po Gramu in mikroskopiramo. Za izolacijo in kopičenje čiste kulture eno izolirano kolonijo ali več različnih izoliranih kolonij nacepimo v ločene epruvete s poševnim agarjem ali kakšnim drugim hranilnim medijem. Da bi to naredili, del kolonije odstranimo z zanko, ne da bi se dotaknili sosednjih kolonij.
Tretja faza: Upoštevajte naravo rasti izbrane čiste kulture. Za vizualno čisto kulturo je značilna enakomerna rast. Mikroskopski pregled obarvanega razmaza, pripravljenega iz takšne kulture, razkrije morfološko in tinktorsko homogene celice. Vendar pa v primeru izrazitega polimorfizma, ki je značilen za nekatere vrste bakterij, v brisih iz čiste kulture poleg tipičnih najdemo tudi druge celične oblike.
23. Metode izolacije čistih kultur anaerobov.
Hranilni mediji za anaerobe morajo izpolnjevati naslednje osnovne zahteve: 1) zadovoljevati prehranske potrebe; 2) zagotoviti hitro rast mikroorganizmov; 3) ustrezno zmanjšati
Pridelki za izolacijo anaerobne mikroflore, tako spore (klostridij) kot nespore (veillonella, bakteroidi, peptokoki), se izvajajo v strogo anaerobnih pogojih. Primarne inokulacije se opravijo na obogatitvenih gojiščih (tioglikol, Kitta-Tarozzi), nato se subkulturirajo na trdnih gojiščih: sladkornem krvnem agarju v petrijevkah, v visokem stolpcu sladkornega hranilnega agarja ali drugih gojiščih, da se pridobijo izolirane kolonije. Po inkubaciji inokulacij v anaerobnih pogojih se iz nastalih bakterijskih kolonij pripravijo brisi, ki se mikroskopsko obarvajo in nato subkulturirajo na gojišče Kitt-Tarozzi in agar gojišča, da se izolira čista kultura.
Ko izoliramo anaerobne bakterije, ki tvorijo spore (klostridije), začetne posevke segrevamo v vodni kopeli pri temperaturi 80 ° C 20 minut, da uničimo vegetativne celice tuje mikroflore, ki je lahko prisotna v preskusnem materialu.
24. Identifikacija mikroorganizmov morfološka, kulturna, serološka, biološka, genetska.
Identifikacija je določitev sistematičnega položaja, selekcija iz katerega koli vira do ravni vrste ali različice.
25. Metoda biokemijske identifikacije: določanje proteolit. saharolitične, lipolitične lastnosti, detekcija hemolizinov in oksidoreduktaz. Uporaba avtomatskih mikrobioloških analizatorjev .
Ta metoda vključuje preučevanje encimske razgradnje različnih substratov (ogljikovih hidratov, aminokislin in beljakovin, sečnine, vodikovega peroksida itd.) s tvorbo vmesnih in končnih
izdelkov.
Karbohidraze- Encimi, ki razgrajujejo ogljikove hidrate. Z določanjem karbohidraz, t.i. saharolitične lastnosti mikrobov. V ta namen se uporabljajo naslednji mediji:
a) Hissov medij (tekoč in poltekoč z indikatorji). Kot slednji se uporablja Andredejev reagent, bromtimol modro ali BP.Encimsko aktivnost bakterij ocenjujemo po spremembi barve medija in tvorbi plina;
b) diferencialno diagnostični mediji z laktozo (Endo, Levina, Ploskireva itd.);
c) polikarbohidratni mediji (kot so Olkenitsky, Kligler itd.).
Proteaze-encimi, ki razgrajujejo beljakovine
a) proučevana kultura lahko cepi substratne beljakovine s tvorbo peptona, albumoze, aminokislin. Ta proces je posledica encimov-proteinaz in peptidaz. Za identifikacijo teh encimov se proučevana kultura nacepi na več gojišč: strjena sirotka, kolona želatine (utekočinjenje v pozitivnih primerih), mlečni agar v petrijevki (v pozitivnih primerih se okrog kolonij pojavijo motna območja);
b) cepitev aminokislin z mikrobi lahko poteka z dekarboksilacijo ali z deaminacijo. V prvem primeru nastanejo amini iz ene ali druge aminokisline, ki jih zaznamo z elektroforezo. ali z alkalizacijo okolja. Prisotnost deaminaz v mikrobu ocenjujemo po nastanku amoniaka v gojišču kot rezultat procesa deaminacije aminokislin;
c) cepitev triptofanske aminokisline z delovanjem encima triptofanaze spremlja tvorba indola. Slednjo zaznamo s pomočjo lista papirja, navlaženega z oksalno kislino in pritrjenega pod zamašek na hranilni medij. V pozitivnih primerih se papir obarva rdeče;
d) za identifikacijo encimov za cepitev aminokislin, ki vsebujejo žveplo (cistin, cistein), se opravijo testi za H2S, kot produkt cepitve teh aminokislin z desulfurazami. Prisotnost H2S je zaznana tudi v okolju Olkenitskega;
e) za odkrivanje ureaze hranilnemu mediju z nevtralnim pH dodamo encim, ki razgrajuje sečnino, sečnino in indikator. V pozitivnih primerih medij spremeni barvo zaradi premika pH na alkalno stran zaradi tvorbe amoniaka. Lipaze- encimi za razgradnjo lipidov in lipidov. Najpogosteje lecitinazo določimo z inokulacijo na rumenjakov agar. Lecitinaza razgradi lecitin v fosfoholin in diglicerid. V teh primerih se z rastjo kolonij okoli njih pojavijo opalescentne cone, ki odražajo aktivnost lecitinaze.
Encimi-toksini : Hemolizini - encimi za cepitev fosfolipidne membrane eritrocitov. Ugotovimo jih s kulturo na krvni agar (5-10%). Obstaja b-hemoliza ali popolna hemoliza, ko se okrog kolonij oblikujejo cone razsvetljenja, a-hemoliza, nepopolna hemoliza, v prisotnosti zelenih con okoli kolonij. Odsotnost hemolize se imenuje d-hemoliza.
Citotoksini- encimi, ki imajo toksični učinek na ciljne celice. Na primer, citotoksičnost toksina anaerobnih mikroorganizmov se določi v celični kulturi. V ta namen 1 g materiala (iztrebkov ali drugega) razredčimo v fosfatnem pufru 1:10 w/v, centrifugiramo 30 minut pri 4000 obratih na minuto. Supernatant filtriramo na 20 nm filter, vnesemo v monosloj celične kulture McCoy in inkubiramo pri 37 °C 24-48 ur, dokler ne dosežemo toksičnega učinka.
Imunokemično določanje proizvodnje toksinov: praviloma se uporablja metoda encimskega imunskega testa za določanje številnih eksotoksinov - davice, kolere, stafilokokov itd. Za to se uporabljajo testni sistemi, ki temeljijo na monoklonskih protitelesih proti specifičnemu eksotoksinu.
Pasmokoagulaza Encim, ki koagulira krvno plazmo živali. Določeno v reakciji v epruveti. V 1 ml kunčje ali človeške citratne plazme (cele ali 2- in 4-krat razredčene s fiziološko raztopino) vmešamo zanko dnevne agar kulture mikroba. Zmes inkubiramo v termostatu pri 37 °C. V pozitivnih primerih po 2-4 urah plazma koagulira (pojavi se strdek). Lecitinaza - glej zgoraj.
Oksido-reduktaze:
1. Opredelitev oksidaza. Na filtrirnem papirju, navlaženem z 1% raztopino tetrametil parafenilendiamina, se v zanki nanesejo trakovi testne kulture. V pozitivnem primeru se pojavi vijolično obarvanje trakov (v 1 minuti).
2. Opredelitev katalaze. Na predmetno stekelce nanesemo kapljico 3 % raztopine vodikovega peroksida in vanj vnesemo zanko testne kulture. V prisotnosti katalaze nastanejo kisikovi mehurčki.
3. Opredelitev dehidraz. Prisotnost dehidraz presojamo po redukcijski sposobnosti mikroba, t.j. sposobnost obnavljanja nekaterih organskih barvil (na primer 1% vodna raztopina metilen modrega). Barvilo (akceptor vodika) dodamo v kolono sladkornega agarja (donor vodika) in mikrobno kulturo nacepimo z vbodom. V pozitivnih primerih ga mikrob, ki raste na takem mediju, razbarva.
4. Določitev spektra kratkoverižnih maščobnih kislin (SCFA), Anaerobni mikroorganizmi proizvajajo vmesne produkte, vključno s kratkoverižnimi maščobnimi kislinami in alkoholi, katerih spekter (profil) je različen za različne vrste mikroorganizmov in omogoča identifikacijo mikroorganizmov do rodovne ravni. Najpogosteje preučevane so ocetna, propionska, butilna, izobutilna, valerijanska, izovalerijanska, kaprojska in izokaprojska kislina. Za določanje SCFA se uporablja metoda plinsko-tekočinske kromatografije. Identificirani so mikroorganizmi, kot so aktinomicete, prolionibakterije, eubakterije, bifidobakterije, klostridije.
Bakteriološki laboratoriji zadnja leta uporabljajo komercialne testne sisteme za hitro biokemično identifikacijo (določanje biokemične aktivnosti različnih skupin mikroorganizmov): na primer 20 testov za enterobakterije in 30 testov za anaerobe. Shema identifikacije vključuje naslednje korake:
Kolonije ---- Priprava ---- Uporaba ----- Inkubacija ---- Računovodstvo(+ -) ---- Inter-
suspenzije suspenzije 4 ure 37°C aplikacija v sredo
Kot material za identifikacijo uporabimo dobro izolirano kolonijo na posodi ali čisto kulturo v epruveti, iz katere pripravimo suspenzijo v koncentraciji standarda optične gostote N4, nato dodamo 55 μl suspenzije v vdolbinice z medijem tega preskusnega sistema. Ploščo s trakovi inkubiramo pri 37 °C 4 ure. Računovodstvo se lahko izvede samodejno (z uporabo naprave "ATV") ali vizualno. Rezultat biokemične reakcije se oceni v obliki "+" ali "-" in se vnese v referenčno tabelo, v kateri pozitiven rezultat ustreza numerični izraz, ki ima za posledico določen numerični profil, ki ustreza posebej razvitemu indeksu analitičnega profila, ki vam omogoča hitro identifikacijo enega ali drugega
mikroorganizem.
Pasteurjeva metoda (metoda omejevanja razredčitev). Sestoji iz dejstva, da se iz preučevanega materiala v tekočem hranilnem mediju naredi več zaporednih razredčitev. Da bi to naredili, kapljico inokuluma vnesemo v epruveto s sterilnim tekočim gojiščem, iz katere kapljico prenesemo v naslednjo epruveto in tako nacepimo do 8-10 epruvet. Z vsakim redčenjem se bo število mikrobnih celic, ki vstopijo v gojišče, zmanjšalo in možno je dobiti takšno razredčitev, da bo v celotni epruveti z gojiščem samo ena mikrobna celica, iz katere dobimo čisto kulturo mikroorganizma. se bo razvilo. Ker mikrobi rastejo difuzno v tekočem mediju, tj. zlahka porazdelijo po okolju, je težko izolirati eno mikrobno celico od druge. Tako Pasteurjeva metoda ne zagotavlja vedno čiste kulture. Zato se trenutno ta metoda uporablja predvsem za predhodno zmanjšanje koncentracije mikroorganizmov v materialu, preden ga inokuliramo v gosto gojišče, da dobimo izolirane kolonije.
Metode mehanskega ločevanja mikroorganizmov z uporabo gostih hranilnih medijev. Te metode vključujejo metodo Kocha in metodo Drygalskega.
Kochova metoda (metoda globokega sejanja). Preskusni material vnesemo z bakteriološko zanko ali Pasteurjevo pipeto v epruveto s staljenim gostim hranilnim medijem. Z vrtenjem med dlanmi enakomerno premešamo vsebino epruvete. Kapljico razredčenega materiala prenesemo v drugo epruveto, iz druge v tretjo in tako naprej. Vsebino vsake epruvete, začenši s prvo, vlijemo v sterilne petrijevke. Po strjevanju gojišča v skodelicah jih postavimo v termostat za gojenje.
Za izolacijo anaerobnih mikroorganizmov po metodi Kocha je potrebno omejiti dostop kisika do kulture. V ta namen površino globokega sejanja v petrijevki napolnimo s sterilno mešanico parafina in vazelina (1:1). Inokulum lahko pustite tudi neposredno v epruveti, temeljito premešan z agarnim medijem. Istočasno vatirano čep zamenjamo z gumijastim ali površino agarja prelijemo z mešanico parafina in vazelinskega olja. Za ekstrakcijo zraslih kolonij anaerobnih mikroorganizmov epruvete rahlo segrejemo s hitrim vrtenjem nad plamenom gorilnika. Agar ob stenah se stopi in kolona zlahka zdrsne v pripravljeno petrijevko. Nato kolono agarja prerežemo s sterilnim skalpelom, kolonije odstranimo s sterilno zanko ali sterilnim kapilarnim rezom in prenesemo v tekoči medij.
Metoda Drygalski temelji na mehanskem ločevanju mikrobnih celic na površini gostega hranilnega medija v petrijevkah. Vsaka mikrobna celica, ki se pritrdi na določenem mestu, se začne množiti in tvori kolonijo.
Za setev po metodi Drygalsky se uporablja več petrijevk, napolnjenih z gostim hranilnim medijem. Kapljico preskusnega materiala položimo na površino medija. Nato s sterilno lopatico to kapljico porazdelimo po celotnem hranilnem mediju (setev s trato).
Sejanje se lahko opravi tudi s črto z uporabo bakteriološke zanke. Z isto lopatico ali zanko se setev izvede v drugi, tretji itd. skodelice. Praviloma se mikrobna rast v obliki neprekinjenega plaka pojavi v prvi posodi po kultivaciji cepiva, v naslednjih posodah se vsebnost mikrobov zmanjša in nastanejo izolirane kolonije, iz katerih s presejanjem zlahka izoliramo čisto kulturo.
Tako dobimo neprekinjeno rast v prvih sektorjih, izolirane kolonije pa bodo rasle vzdolž naslednjih potez, ki so potomci ene celice.
Da bi prihranili gojišča in pripomočke, lahko uporabite eno posodo, jo razdelite na sektorje in jih zaporedno inokulirate s potegom (metoda izčrpanega pomika). Da bi to naredili, material vzamemo z zanko in z njim narišemo vrsto vzporednih potez, najprej po površini prvega sektorja, nato pa vse druge sektorje zasejemo s celicami, ki ostanejo na zanki. Z vsakim naslednjim udarcem se število posejanih celic zmanjša.
Metoda za izolacijo čistih kultur z uporabo kemikalij uporablja se pri izolaciji kultur mikroorganizmov, odpornih na nekatere kemikalije. To metodo lahko na primer uporabimo za izolacijo čiste kulture Mycobacterium tuberculosis, ki je odporna na kisline, alkalije in alkohol. V tem primeru se preskusni material pred setvijo prelije s 15% raztopino kisline ali antiformina in hrani v termostatu 3-4 ure. Po izpostavitvi kislini ali alkaliji celice bacila tuberkuloze ostanejo žive, vsi drugi mikroorganizmi, ki jih vsebuje preskusni material, pa umrejo. Po kislinski ali alkalni nevtralizaciji tretirani material posejemo na trden gojišče in pridobimo izolirane kolonije povzročitelja tuberkuloze.
77288 0
Kulturne lastnosti bakterij
Kulturne (ali makromorfološke) lastnosti vključujejo značilne lastnosti rasti mikroorganizmov na trdnih in tekočih hranilnih medijih. Na površini gostih hranilnih medijev lahko mikroorganizmi, odvisno od setve, rastejo v obliki kolonij, kapi ali neprekinjenega travnika.Kolonija je izolirana zbirka celic iste vrste, ki so zrasle iz ene celice (klon celic). Glede na to, kje mikroorganizem raste (na površini gostega hranilnega medija ali v njegovi debelini), se razlikujejo površinske, globoke in spodnje kolonije.
Kolonije, ki so zrasle na površini gojišča, so raznolike: so vrstno specifične in z njihovo študijo ugotavljamo vrstno pripadnost proučevane kulture.
Pri opisovanju kolonij se upoštevajo naslednje značilnosti:
1) oblika kolonije - okrogla, ameboidna, rizoidna, nepravilna itd .;
2) velikost (premer) kolonije - zelo majhna (natančna) (0,1-0,5 mm), majhna (0,5-3 mm), srednje velika (3-5 mm) in velika (več kot 5 mm v premeru) ;
3) površina kolonije je gladka, hrapava, nagubana, nagubana, s koncentričnimi krogi ali radialno progasta;
4) profil kolonije - ravno, konveksno, stožčasto, kratersko itd.;
5) prosojnost - motna, mat, sijoča, prozorna, mokasta;
6) barva kolonije (pigmenta) - brezbarvna ali pigmentirana (bela, rumena, zlata, rdeča, črna), posebej opazno je sproščanje pigmenta v medij z njegovo barvanjem;
7) rob kolonije - enakomeren, valovit, nazobčan, resast itd.;
8) struktura kolonije - homogena, drobno- ali grobozrnata, progasta; rob in strukturo kolonije določimo s povečevalnim steklom ali pri majhni povečavi mikroskopa, tako da petrijevko s sejanjem postavimo na mizico mikroskopa s pokrovom navzdol;
9) doslednost kolonije; določimo z dotikom površine z zanko: kolonija je lahko gosta, mehka, raste v agar, sluzasta (seže po zanki), krhka (lahko se zlomi ob stiku z zanko).
Globoke kolonije so najpogosteje videti kot bolj ali manj sploščene leče (ovalne oblike s koničastimi konci), včasih kepice vate z nitastimi izrastki v hranilni medij. Nastajanje globokih kolonij pogosto spremlja pretrganje gostega medija, če mikroorganizmi sproščajo plin.
Kolonije na dnu so običajno videti kot tanki prozorni filmi, ki se plazijo po dnu.
Značilnosti kolonije se lahko spreminjajo s starostjo, odvisne so od sestave gojišča in temperature gojenja.
Rast mikroorganizmov na tekočih hranilnih medijih se upošteva z uporabo štiri-sedemdnevnih kultur, gojenih v stacionarnih pogojih.
V tekočih hranilnih medijih med rastjo mikroorganizmov opazimo motnost medija, nastanek filma ali usedline.
Pri gojenju na poltekočih (0,5-0,7% agar) hranilnih medijih mobilni mikrobi povzročijo izrazito motnost, stacionarne oblike rastejo le med setvijo z vbrizgavanjem v medij.
Pogosto rast mikrobov spremlja pojav vonja, pigmentacija medija in sproščanje plina. Značilen vonj kultur nekaterih vrst bakterij je povezan s tvorbo različnih estrov (etil ocetne kisline, amil ocetne kisline itd.), Indola, merkaptana, vodikovega sulfida, skatola, amoniaka, maslene kisline.
Sposobnost tvorbe pigmentov je lastna številnim vrstam mikroorganizmov. Kemična narava pigmentov je raznolika: karotenoidi, antocianini, melanini. Če je pigment netopen v vodi, je obarvan samo kulturni plak; če je topna, se obarva tudi hranilni medij. Menijo, da pigmenti ščitijo bakterije pred škodljivimi učinki sončne svetlobe, zato je v zraku toliko pigmentiranih bakterij, poleg tega pigmenti sodelujejo pri presnovi teh mikroorganizmov.
V naravi obstajajo tako imenovane fosforescentne bakterije, katerih kulture svetijo v temi z zelenkasto-modrikasto ali rumenkasto svetlobo. Takšne bakterije najdemo predvsem v rečni ali morski vodi. Svetlobne bakterije - fotobakterije - vključujejo aerobne bakterije (vibriosi, koki, palice).
Izolacija čistih kultur mikroorganizmov
Čista kultura je kultura, ki vsebuje mikroorganizme ene vrste. Izolacija čistih bakterijskih kultur je obvezna faza bakterioloških raziskav v laboratorijski praksi, pri preučevanju mikrobne kontaminacije različnih okoljskih predmetov in na splošno pri vsakem delu z mikroorganizmi.Material, ki ga proučujemo (voda, prst, zrak, hrana ali drugi predmeti), običajno vsebuje združbe mikrobov.
Izolacija čiste kulture omogoča preučevanje morfoloških, kulturnih, biokemičnih, antigenskih in drugih značilnosti, katerih celota določa vrsto in vrsto patogena, tj.
Za izolacijo čistih kultur mikroorganizmov se uporabljajo metode, ki jih lahko razdelimo v več skupin:
1. Pasteurjeva metoda - zaporedno redčenje preskusnega materiala v tekočem hranilnem mediju do koncentracije ene celice na volumen (ima zgodovinski pomen).
2. Kochova metoda ("plate wiring") - zaporedno redčenje testnega materiala v staljenem agarju (temperatura 48-50 C), čemur sledi vlivanje v petrijevke, kjer se agar strdi. Sejanje poteka praviloma iz zadnjih treh ali štirih razredčin, kjer je malo bakterij, kasneje pa se z rastjo na petrijevkah pojavijo izolirane kolonije, ki nastanejo iz ene izvorne matične celice. Iz izoliranih kolonij v globini agarja dobimo čisto kulturo bakterij s subkulturo na svežih gojiščih.
3. Metoda Shukevich - uporablja se za pridobivanje čiste kulture Proteusa in drugih mikroorganizmov z "plazečo" rastjo. Inokulacija preskusnega materiala se izvede v kondenzacijski vodi na dnu poševnega agarja. Gibljivi mikrobi (Proteus) se lahko dvignejo po poševnici agarja, nepremične oblike ostanejo rasti na dnu, na mestu zasejanja. S subkulturo zgornjih robov kulture lahko dobimo čisto kulturo.
4. Metoda Drygalskyja - se pogosto uporablja v bakteriološki praksi, medtem ko se preskusni material razredči v epruveti s sterilno fiziološko raztopino ali juho. Eno kapljico materiala dodamo v prvo skodelico in jo s sterilno stekleno lopatico razmažemo po površini gojišča. Nato z isto lopatko (brez žganja v plamenu gorilnika) enako sejemo v drugo in tretjo skodelico.
Z vsakim sejanjem bakterij na lopatko jih je vse manj in pri sejanju na tretjo skodelico se bodo bakterije porazdelile po površini hranilnega medija ločeno druga od druge. Po 1-7 dneh držanja plošč v termostatu (odvisno od hitrosti rasti mikroorganizmov) na tretji plošči vsaka bakterija da klon celic, ki tvorijo izolirano kolonijo, ki jo subkulturirajo na poševnem agarju, da se kopičijo čisto kulturo.
5. Weinbergova metoda. Posebne težave nastanejo pri izolaciji čistih kultur obveznih anaerobov. Če stik z molekularnim kisikom ne povzroči takojšnje celične smrti, se sejanje izvede po metodi Drygalsky, nato pa se skodelice takoj postavijo v anaerostat. Vendar se pogosteje uporablja metoda vzreje. Njegovo bistvo je v tem, da se razredčitev preskusnega materiala izvaja v staljenem in ohlajenem na 45-50 ° C agar hranilnem mediju.
Naredimo 6-10 zaporednih razredčitev, nato medij v epruvetah hitro ohladimo in površino prekrijemo s plastjo mešanice parafina in vazelinskega olja, da preprečimo prodiranje zraka v debelino hranilnega medija. Včasih se hranilni medij po inokulaciji in mešanju prenese v sterilne Burrijeve epruvete ali Pasteurjeve kapilarne pipete, katerih konci so zatesnjeni. Z uspešnim redčenjem v epruvetah, Burrijevih epruvetah, Pasteurjevih pipetah zrastejo izolirane kolonije anaerobov. Da bi bile izolirane kolonije dobro vidne, se uporabljajo očiščena hranilna gojišča.
Za ekstrakcijo izoliranih kolonij anaerobov epruveto rahlo segrejemo z vrtenjem nad plamenom, medtem ko se agar ob stenah stopi in vsebina epruvete v obliki agarjeve kolone zdrsne v sterilno petrijevko. Stolpec agarja prerežemo s sterilno pinceto in z zanko odstranimo kolonije. Ekstrahirane kolonije postavimo v tekoče gojišče, ugodno za razvoj izoliranih mikroorganizmov. Gojišče z agarjem odstranimo iz Burrijeve epruvete tako, da plin spustimo skozi vatirano palčko.
6. Hungateova metoda. Kadar želijo pridobiti izolirane kolonije bakterij s posebno visoko občutljivostjo na kisik (strogi aerobi), se uporablja metoda Hungate rotacijske cevi. Da bi to naredili, se staljeni agarni medij nacepi z bakterijami pri enosmernem toku skozi epruveto z inertnim plinom, osvobojenim kisikovih nečistoč. Nato se epruveta zapre z gumijastim zamaškom in vodoravno položi v objemko, ki vrti epruveto; medij se enakomerno porazdeli po stenah epruvete in se strdi v tanki plasti. Uporaba tanke plasti v epruveti, napolnjeni s plinsko mešanico, omogoča pridobivanje izoliranih kolonij, ki so jasno vidne s prostim očesom.
7. Izolacija posameznih celic z mikromanipulatorjem. Mikromanipulator - naprava, ki omogoča uporabo posebne mikropipete ali mikrozanke za odstranitev ene celice iz suspenzije. Ta operacija se nadzoruje pod mikroskopom. Na mizico mikroskopa je nameščena mokra komora, v katero se namesti preparat "viseča kapljica". V nosilcih operacijskih stojal so pritrjene mikropipete (mikrozanke), katerih gibanje v vidnem polju mikroskopa se izvaja z mikronsko natančnostjo zahvaljujoč sistemu vijakov in vzvodov. Raziskovalec, ki gleda skozi mikroskop, z mikropipetami ekstrahira posamezne celice in jih prenese v epruvete s sterilnim tekočim medijem, da dobi celični klon.
L.V. Timoščenko, M.V. Chubik
Pasteurjeva metoda Kochova metoda Biološka fizikalna
(ima zgodovinske (lamelne
vrednost) ožičenje) Shchukevich Chemical Method
Moderno
Sejanje z zanko Sejanje z lopatko
(metoda Drigalski)
Metode za izolacijo čistih kultur (Shema 11):
1. Metode mehanskega sproščanja temelji na ločevanju mikrobov z zaporednim mletjem testnega materiala po površini agarja.
A) Pasteurjeva metoda– ima zgodovinski pomen, zagotavlja dosledno redčenje preskusnega materiala v tekočem hranilnem mediju z metodo valjanja
b) Kochova metoda- metoda postavitve plošče - temelji na sekvenčnem redčenju testnega materiala z mesno-peptonskim agarjem, ki mu sledi vlivanje epruvet z razredčenim materialom v petrijevke.
V) Metoda Drygalski- pri setvi materiala, ki je obilno zasejan z mikrofloro, uporabite 2-3 skodelice za zaporedno setev z lopatico.
G) Petljasta setev z vzporednimi potezami.
2. biološke metode temelji na bioloških lastnostih patogenov.
A) Biološki- okužba zelo občutljivih živali, kjer se mikrobi hitro razmnožujejo in kopičijo. V nekaterih primerih je ta metoda edina, ki vam omogoča izolacijo kulture patogena od bolne osebe (na primer s tularemijo), v drugih primerih pa je bolj občutljiva (na primer izolacija pnevmokoka pri belih miših). ali povzročitelj tuberkuloze pri morskih prašičkih).
b) Kemični– na osnovi kislinske odpornosti mikobakterij. Da material osvobodimo spremljevalne flore, ga
obdelamo s kislinsko raztopino. Rastejo le bacili tuberkuloze, saj kislina uniči kislinsko tolerantne mikrobe.
V) fizikalna metoda ki temelji na odpornosti spor na toploto. Za izolacijo kultur bakterij, ki tvorijo spore, iz
zmesi material segrejemo na 80°C in nacepimo na hranilni medij. Rastejo samo spore bakterij, ker so njihove spore ostale žive in so dale rast.
G) Shchukevicheva metoda- temelji na visoki mobilnosti vulgarnega proteusa, ki je sposoben plazeče rasti.
Metoda prenosa iz kolonij na poševni agar in BCH:
A) Prenos iz kolonij v poševni agar
Pokrov skodelice rahlo odpremo, s kalcinirano ohlajeno zanko odstranimo del posamezne kolonije, odpremo epruveto s sterilnim poševnim agarjem in jo držimo v levi roki v nagnjenem položaju, tako da površina medij je mogoče opazovati. Zanko s kulturo prenesemo v epruveto, ne da bi se dotaknili sten, podrgnemo po hranilnem mediju, drsimo po površini od enega konca epruvete do drugega, dvignemo poteze do vrha gojišča - sejemo z kap. Epruveta se zapre in, ne da bi jo izpustili, se podpiše ime posejanega mikroba in datum setve.
b) Prenos iz kolonije v mesno-peptonsko juho
Tehnika presaditve na MPB je v osnovi enaka kot pri setvi na gosto podlago. Pri setvi na BCH je zanka z materialom na njej potopljena v gojišče. Če je material viskozen in ga ne odstranimo iz zanke, ga podrgnemo po steni posode in nato speremo s tekočim medijem. Tekoči material, zbran s sterilno Pasteurjevo ali graduirano pipeto, se vlije v hranilni medij.
Kot rezultat samostojnega dela mora študent vedeti:
1. Metode za izolacijo čiste kulture mikroorganizmov
2. Metode gojenja mikroorganizmov
Biti sposoben:
1. Spretnosti za upoštevanje pravil protiepidemičnega režima in varnostnih ukrepov
2. Razkužite material, obdelajte roke
3. Pripravite pripravke iz bakterijskih kolonij
4. Mikroskopirajte kolonije
5. Mikroorganizmi obarvani po Gramu
AKTIVNOST 8
ZADEVA. Metode za izolacijo čistih kultur (nadaljevanje). Encimska aktivnost bakterij in metode za njeno preučevanje.
Čista kultura je skupek mikroorganizmov, ki pripadajo isti vrsti. Pridobivanje tega materiala je nujen trenutek raziskav pri izvajanju laboratorijskih diagnostičnih tehnik. Za izolacijo čistih bakterijskih kultur se uporabljajo brisi iz krvi, sputuma, blata, pregleda se gnojni in drug biološki material. V naravnih razmerah (v zraku, vodi, zemlji), živilih, v truplih (človeških, živalskih) so združenja različnih vrst mikroorganizmov.
Ločevanje čiste kulture je pomembno za podrobno študijo lastnosti mikrobov: morfoloških, kulturnih, biokemičnih in tudi antigenskih. Na podlagi rezultatov teh raziskovalnih metod je mogoče ugotoviti, da patogen pripada določeni vrsti in vrsti, z drugimi besedami, opraviti njegovo identifikacijo.
Načela biološkega ločevanja bakterij pomenijo upoštevanje značilnosti vitalne aktivnosti mikrobov, da se izberejo najbolj optimalne raziskovalne metode. Izbrane metode se morajo v določenih parametrih ujemati s patogenom.
- Vrsta dihanja. Med bakterijami ločimo skupine aerobnih in anaerobnih predstavnikov. Za pridobitev anaerobnih mikrobov se raziskovalni material segreje. Naslednja faza je gojenje mikroba v anaerobnih pogojih. Metode pridobivanja aerobnih in anaerobnih bakterij so različne.
- Sporulacija. Sposobnost nekaterih bakterij za sporulacijo zagotavlja zaščito in varnost mikroorganizmov.
- Odpornost bakterij na agresivne učinke alkalij in kislin. Odpornost nekaterih vrst bakterij na te snovi zagotavlja maksimalno čiščenje preskusnega materiala iz primesi drugih bakterij z uporabo alkalijskih ali kislinskih raztopin.
- Mobilnost bakterijskih organizmov. Za ločevanje čiste kulture gibljivih mikroorganizmov se uporabljajo metode ločevanja kultur mikrobov v kapljici kondenzata.
- Občutljivost mikroorganizmov za antibiotike, nekatere kemikalije in druga protimikrobna sredstva. Za nekatere patogene so najbolj zaželene metode izolacije kulture z uporabo selektivnih (specifičnih) hranilnih gojišč.
- Antibiotiki. Očistite material pred dodatnimi mikroorganizmi.
- Sposobnost bakterij, da prodrejo v nepoškodovano kožo. Ta lastnost je lastna nekaterim sortam, ki imajo dejavnike agresije.
- Dovzetnost živali za nekatere bolezni nalezljivega izvora.
Metode ocenjevanja patogenov
Za pridobivanje čistih kultur bakterijskih celic se uporabljajo številne metode. Vsak od njih se uporablja v določeni situaciji in ima zaporedne jasne korake za pridobivanje kolonij patogena. Razmislite o najbolj priljubljenih.
Pasteurjeva tehnika
To je redčenje čistih kultur v mediju za rast bakterij (tekoča konsistenca) do koncentracije 1 celice na volumen tekočine. Ta način izbire je velikega zgodovinskega pomena.
Kochova tehnika
Znana tudi kot tehnika "plate spread". Je razredčitev materiala za raziskave v agarju (v staljenem stanju s temperaturo 48-50 ° C). Nato dobljeno sestavo vlijemo v petrijevke, kjer naj se strdi.
Pridelki se običajno izvajajo iz zadnjih 3-4 razredčenj, saj je tam že malo bakterij. Tako se med rastjo mikrobov na hranilnem mediju pojavijo izolirane kolonije mikroorganizmov, ki se rodijo iz ene matične celice. Nato lahko izolirano kolonijo izberemo iz globine agarja in jo prenesemo na svež hranilni medij. Naslednji korak je identifikacija in izolacija patogena.
Shukevičeva tehnika
Uporablja se, kadar je treba izolirati čisto kulturo aerobov Proteus ali katerega koli drugega mikroba, za katerega je značilna "plazeča" rast. Kulture posadite v vodo, kondenzirano na dnu poševnega agarja.
S to metodo ločevanja čiste kulture se mobilni celični organizmi (Proteus) dvignejo na vrh poševnice agarja, nepremične oblike pa ne spremenijo svoje lokacije na semenskem mediju. S subkulturo zgornjih robov kaljene kulture lahko dobimo čisto bakterijsko kulturo.
Tehnika Drygalskega
Metoda Drygalsky se precej pogosto uporablja pri preučevanju biološkega materiala z redčenjem kultur v epruveti z brozgo ali fiziološko raztopino.
Naslednji korak: eno kapljico nastale raztopine s sterilno stekleno lopatico enakomerno porazdelimo po površini hranilnega medija v 1. skodelici. Nato, ne da bi žgali lopatko na ognju, naredijo enako setev na 2. in 3. skledi. Bistvo metode Drygalsky je, da je z vsako naslednjo setvijo kultur koncentracija bakterij (aerobov) vedno manjša. Na 3. plošči so razporejeni precej narazen, vsaka bakterijska celica povzroči nastanek klonskih celic (v obliki izolirane kolonije). Za kopičenje patogenov se subkulturirajo na poševnem agarju.
Weinbergova tehnika
Določene težave povzroča izolacija čistih kultur anaerobnih patogenov, če mikroorganizmi ne poginejo ob stiku z molekulami kisika. Bistvo tehnike je odstranitev anaerobnih mikrobov (v sestavi materiala) v rahlo ohlajenem (45-50 ° C) staljenem hranilnem mediju (agaroz). Porabite 6-10 razredčitev. Nato pride naslednja faza: sestavo v epruveti je treba hitro ohladiti in njeno površino napolniti z mešanico vazelina in parafinskega olja, ki preprečuje prodiranje zraka in spodbuja razvoj anaerobnih razmer.
Ob ugodni setvi že drugi dan vzklijejo izolirane kolonije, ki jih odstranimo iz epruvete s segrevanjem z gorilnikom. Kulture se vzamejo iz izrezanega stolpca agarja za nadaljnje preiskave. Nastale kolonije damo v tekoči hranilni medij, kjer lahko zaključimo korake za izolacijo kolonije anaerobnih patogenov.
Hungate tehnika
Pogosto se uporablja za izolacijo aerobnih mikrobov z visoko občutljivostjo na kisik. Pri izvajanju takšne izolacije kulture aerobov se uporablja tehnika vrtljivih epruvet.
Metode inokulacije aerobnih bakterij vključujejo njihovo razmnoževanje na staljenem agarskem gojišču. Prisotnost inertnega plina v epruveti omogoča gojenje izoliranih kolon aerobnih bakterij na tak način, da so izolirane kulture aerobov jasno vidne tudi s prostim očesom 2-3 dni.
Mikromanipulator
To je tehnika za izolacijo posameznih bakterijskih celic z uporabo mikromanipulatorja. Mikromanipulator je posebna naprava, ki lahko ujame eno celico iz suspenzije, pa tudi omogoča sejanje kulture v epruveto.
Nadaljnja identifikacija patogena se izvaja ob upoštevanju vseh navedenih lastnosti patogena (aerobi in anaerobi), pa tudi značilnosti njihove interakcije z različnimi snovmi.
